介紹
在制藥和醫(yī)療器械生產(chǎn)過程中，對污染物樣品的監(jiān)測是一個關(guān)鍵步驟。內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中，是一種常見的污染物，可引起發(fā)燒、炎癥、頭痛、惡心，甚至死亡。內(nèi)毒素的常規(guī)檢測方法是鱟試劑溶酶法 (LAL)，核心成分由鱟的血液中提取而來。在內(nèi)毒素存在的情況下，LAL 通過酶促級聯(lián)凝固，可以通過比濁法或顯色法定量 ( 圖 1A )。這些方法涉及多個酶的步驟，并取決于鱟的可用性。
2021 年 2 月 5 日，國家林業(yè)和草原局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告，調(diào)整后的的《 國家重點保護野生動物名錄 》正式發(fā)布，將我國分布的鱟科動物 ( 中國鱟、圓尾蝎鱟 ) 升級為國家二級保護動物。中國藥典 2020 年版 9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中指出，目前新的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法不斷出現(xiàn)，以適應(yīng)特殊品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的需要，或減少鱟試劑的使用量。如重組 C因子法 ( 見附 )、微量凝膠法等。
附：重組 C 因子法
C 因子是鱟試劑中對細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內(nèi)毒素。重組 C 因子是一種人工合成的 C 因子，它被細(xì)菌內(nèi)毒素活化后，可與熒光底物作用產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成比例的熒光信號。

儀器型號
? SpectraMax M2e 多功能微孔板讀板機
? SpectraMax M5e 多功能微孔板讀板機
? SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機
? SpectraMax iD3 多功能微孔板讀板機

本法系依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其孵育終止時的熒光值之間存在量化關(guān)系來測定細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，本法為終
點熒光法。依據(jù)檢測原理，本法不存在 G 因子旁路干擾，具有較高的專屬性，因此 適合于含有 β- 葡聚糖 干擾的樣品檢
測；本法所用試劑不含有 B 因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此，含有對上述物質(zhì)抑制或增強作用的樣品適合使用重組 C因子法。
重組 C 因子法實驗需采用熒光酶標(biāo)儀，其激發(fā)和發(fā)射波長等參數(shù)參照試劑的使用說明書，激發(fā) / 發(fā)射波長一般為380nm/440nm，檢測溫度一般為 37℃ ±1℃ 。

材料
? Rhinogen 重組 C 因子內(nèi)毒素檢測試劑盒 ( 產(chǎn)品貨號 : RAF-01 )
? 一次性無熱源安瓿瓶 (Rhinogen)
? 無熱源、低吸附移液頭 (QSP#Cat.TF112-1000-Q, TF140-200-Q)
? 一次性無菌無熱源 96 孔白板 (Nunc#Cat.136101)
? 細(xì)菌內(nèi)毒素國家工作標(biāo)準(zhǔn)品
? SpectraMax M2e 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #M2e)
? SpectraMax? M5e 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #M5e)
? SpectraMax? i3x 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #i3x)
? SpectraMax? iD3 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #iD3)
? SoftMax Pro 軟件 (Molecular Devices)
方法
1. 取用 4 支一次性無熱原安瓿瓶，在瓶身標(biāo)明內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度 ( 分別 0.005、0.05、0.5 及 5 EU/ml )，用溶
解至 20 EU/ml 的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 提前將微孔板讀板機的溫度設(shè)置 37℃ 待用。將 100 μl 陰性對照 ( 無熱原水 )、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品 ( 兩組 )
分別加入到 96 孔無菌無熱原白板相應(yīng)孔中，2 復(fù)孔。兩組樣品中分別加入 10 μl 0.5 EU/ml 的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為加標(biāo)樣品組。加樣后的 96 孔板在 37℃ ± 1℃ 的微孔板讀板機中，預(yù)熱 10-20 分鐘。
3. 微孔板預(yù)熱時，配置底物試劑。按照 5:4:1 的比例混合熒光底物溶液、測定緩沖液 和 rFC 酶溶液，輕輕地充分混合，切勿漩渦混合。

4. 設(shè)置讀板參數(shù)：
激發(fā) / 發(fā)射波長設(shè)置為 380/440 nm，PMT Gain 設(shè)置 成Automatic，頂讀。以 i3x 為例，酶標(biāo)儀讀板設(shè)置如右圖
所示。取出預(yù)熱的 96 孔板，向所有樣品孔中加入 100 μl/孔底物試劑。
讀取 0h 的相對應(yīng)熒光強度T0，將微孔板繼續(xù) 37℃ ±1℃ 孵育 1 h，讀取 1 h 的相對熒光強度 T1。
5. 數(shù)據(jù)分析：
所有孔的 ΔRFU = T1-T0標(biāo)準(zhǔn)品 / 樣品凈 ΔRFU = 標(biāo)準(zhǔn) 品 / 樣 品 ΔRFU- 陰性對照 ΔRFU以內(nèi)毒素 工作 標(biāo) 準(zhǔn)品溶液
濃度為橫坐標(biāo)，凈 ΔRFU為縱坐標(biāo)繪圖并進行 LogLog 擬合，log (ΔRFU) = A*log ( 內(nèi) 毒 素 濃 度 EU/ml )+ B

結(jié)果
Molecular Devices 的 4 款微孔板讀板機，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3 和 SpectraMax i3x 均符合重組 C 因子試劑盒檢測要求。我們已根據(jù) Rhinogen 重組 C 因子內(nèi)毒素檢測試劑盒的說明書編輯好了模板，如有需要只需調(diào)用模板讀數(shù)即可。
標(biāo)準(zhǔn)曲線以內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，凈 ΔRFU為縱坐標(biāo)繪圖并進行 Log-Log 擬合。標(biāo)準(zhǔn)品有 5 個梯度 (0，0.005 EU/ml，0.05 EU/ml，0.5 EU/ml，5EU/ml)，每個樣品 2復(fù)孔。所有 4 款型號儀器的 R2 值都在 0.998 以上，加標(biāo)回收率也都在中國藥典 2020 版要求以內(nèi)。具體數(shù)據(jù)如下，

結(jié)論
Molecular Devices 的 4 款多功能微孔板讀板機，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3 和 SpectraMax i3x 均能夠進行重組 C 因子檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線展現(xiàn)了完美的線性，SpectraMax i3x R2 值達(dá)到了 1.000。3 款儀器樣品 2 復(fù)孔 CV 值小于 5%，展現(xiàn)了優(yōu)異的復(fù)孔重現(xiàn)性；加標(biāo)回收率在 82%~113% 之間，明顯優(yōu)于中國藥典 2020 版要求 50%~200% 的范圍。SoftMax Pro 軟件可用于分析數(shù)據(jù)，凈 ΔRFU 值用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動計算生成 R2 和 CV 值，調(diào)用現(xiàn)成的模板還會自動計算出樣品的加標(biāo)回收率并作結(jié)果判讀。