精簡(jiǎn)版
我們提供給您符合中國(guó)藥典生物檢定法要求 的 4.4 法分析模板，第一步將模 板導(dǎo)入 SoftMax Pro 7 軟件，第二步點(diǎn)擊Read 進(jìn)行板測(cè)讀，隨后平行線性擬合、方差分析和可靠性檢驗(yàn)結(jié)果、供試品效價(jià)及其可信限全部自動(dòng)計(jì)算出來(lái)。
肝素及其效價(jià)測(cè)定方法介紹
肝素首先從肝臟發(fā)現(xiàn)而得名，它也存在于肺、血管壁、腸粘膜等組織中，是一種由動(dòng)物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞合成的粘多糖，是由二種多糖交替連接而成的多聚體。它是一種天然的抗凝血物質(zhì)，在體內(nèi)外都有抗凝血作用，臨床上常用其鈉鹽或鈣鹽。肝素鈉或肝素鈣注射液主要是從豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽或鈣鹽，作為迅速達(dá)到抗凝作用的shouxuan藥物，被廣泛用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)、血液透析等。隨著藥理學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的進(jìn)展，肝素的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。
肝素類產(chǎn)品的效價(jià)不能用化學(xué)或物理的方法進(jìn)行確切測(cè)定，只能采用生物檢定法測(cè)定，即利用藥物對(duì)生物體的作用并與標(biāo)準(zhǔn)品加以比較以測(cè)定其效價(jià)和生物活性的一種方法。目前體外的抗凝活性實(shí)驗(yàn)主要有血漿法和生色底物法，血漿法雖然可以全面衡量肝素的抗凝活性，卻很難標(biāo)準(zhǔn)化；生色底物法測(cè)定肝素鈉的抗 IIa 因子和 Xa 因子活性雖然不能完全反映肝素鈉的活性，但國(guó)際上通常采用這種方法來(lái)確定肝素鈉的效價(jià)。歐洲藥典 5.0 版和我國(guó)藥典均采用該方法，美國(guó)藥典從 2009 年開(kāi)始采用生色抗 IIa 因子測(cè)定法代替此前藥典中的羊血漿法測(cè)定肝素效價(jià)。生色底物法Z大的優(yōu)點(diǎn)是它在效價(jià)測(cè)定中的高度專一性，能夠識(shí)別出此前藥典中血漿法不能識(shí)別的肝素相似性潛在藥物，并且酶標(biāo)儀的使用使常規(guī)測(cè)定自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。

儀器型號(hào)
? SpectraMax M2e 多功能微孔板讀板機(jī)
? SpectraMax M5e 多功能微孔板讀板機(jī)
? SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機(jī)
? SpectraMax iD3 多功能微孔板讀板機(jī)

生色底物法的原理是通過(guò)微量顯色法比較肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品 S 與供試品 T 抗 IIa 因子和 Xa 因子的活性，以測(cè)定供試品的效價(jià)。效價(jià)是某種藥物達(dá)到一定效應(yīng)時(shí)所需的劑量，產(chǎn)生相同效應(yīng)藥物的劑量比較時(shí)，所需劑量越小，藥物的效價(jià)就越高，反之效價(jià)就低。在人或動(dòng)物體內(nèi)，發(fā)生凝血作用的主要是凝血酶，低分子肝素在人體內(nèi)與抗凝血酶形成絡(luò)合物，然后抑制凝血酶 ( IIa 因子或 Xa 因子 ) 的活性，達(dá)到抗凝血的作用，剩余未被抑制的 IIa 因子或 Xa 因子與生色底物作用顯色，使用酶標(biāo)儀在 405nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度，終溶液的吸光度值與低分子肝素的效價(jià)成反比。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液 ( 或供試品系列溶液 ) 濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別作線性回歸，按生物檢定統(tǒng)計(jì)法 ( 通則 1431 ) 中的量反應(yīng)平行線原理 4.4 法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差，藥典要求可信限率(FL%) 不得大于 10 %。
使用 SoftMax Pro 7 軟件進(jìn)行肝素效價(jià)測(cè)定
生物檢定統(tǒng)計(jì)法中涉及 到 的 F 檢驗(yàn)分析方法的推算比較復(fù)雜，大多數(shù)酶標(biāo)儀的軟件是無(wú)法完成這些計(jì)算的，但是，
Molecular Devices 公司的酶標(biāo)儀軟件 SoftMax Pro 7 具備強(qiáng)大的函數(shù)編寫能力，能夠幫助實(shí)驗(yàn)人員完成藥典中要求的
生物檢定統(tǒng)計(jì)法的所有分析方法，包括量反應(yīng)平行線測(cè)定法和四參數(shù)回歸計(jì)算法。下面小編以一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)詳細(xì)說(shuō)明，在SoftMax Pro 7 軟件中如何進(jìn)行肝素生物效價(jià)的測(cè)定，并將方差分析和和測(cè)定結(jié)果與 BS2000 軟件進(jìn)行比較。
1. 加樣原則
為了減小實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)操作誤差，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該按照均衡分配各樣品在 96 孔微孔板中的不同位置。例如在一塊 96 孔微孔板
上分配一組標(biāo)準(zhǔn)品溶液 S1~S4 和一組供試品溶液 T1~T4，可以采用 STTS 的樣品排列方式 ( 見(jiàn)圖 1 )。操作熟練的實(shí)驗(yàn)人員可以選擇同一次反應(yīng)內(nèi)測(cè)定多批供試品的效價(jià)，同時(shí)測(cè)定兩批供試品 (A 和 B) 可采用 SABBAS 的排列方式；依次類推，同時(shí)測(cè)定三批供試品 ( A、B 和 C ) 可采用 SABCCBAS 的排列方式 ( 見(jiàn)圖 2 )。
 

2. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)讀
在 SoftMax Pro 7 軟件中進(jìn)行相應(yīng)排列方式的板布局設(shè)置，并輸入標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液和供試品系列溶液的劑量。本次實(shí)驗(yàn)
只有一組標(biāo)準(zhǔn)品溶液和一組供試品溶液，S 和 T 采用同等劑量稀釋， Z大劑量是 0.049 IU/ml，高低劑量劑間比是 1.4，然后在 405 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行讀數(shù)，稀釋劑量和檢測(cè)結(jié)果如圖 3所示。

3. 平行線性擬合
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品 S 和供試品 T 的對(duì)數(shù)劑量和反應(yīng)關(guān)系的兩條直線相互平行時(shí)，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的活性組分才是相同的，進(jìn)而才
能計(jì)算 S 和 T 的等反應(yīng)劑量，從而對(duì)比出供試品的效價(jià) Pt，所以曲線的平行性分析是生物效價(jià)測(cè)定的前提。在 SoftMaxPro 軟件中，以對(duì)數(shù)劑量作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，對(duì) S 和 T 進(jìn)行平行線性擬合 ( 即線性約束模型擬合 )，兩條直線強(qiáng)制變?yōu)槠叫?，S 和 T 擬合方程的 B 參數(shù) ( 代表斜率 ) 的估計(jì)值是相同的，僅 A 參數(shù) ( 代表水平截距 ) 的估計(jì)值不同。在95% 的置信水平下，軟件自動(dòng)計(jì)算出 F 檢驗(yàn)概率值 (F Prob)，見(jiàn)圖 4 紅框所示， F Prob > 0.05，表明兩條直線是平行的，反之兩條直線是不平行的。