簡介
G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCRs) 是藥物發(fā)現(xiàn)研究中Z重要的治療靶點之一。GPCRs 是膜定位蛋白，在細(xì)胞信號通路中起重要作用。當(dāng)受體被配體激活時，受體的構(gòu)象被改變，激活細(xì)胞內(nèi)的 G 蛋白?；钚?G 蛋白有可能誘導(dǎo)各種細(xì)胞內(nèi)信使級聯(lián)，包括鈣離子。
鈣激活發(fā)光蛋白是檢測受體介導(dǎo)的哺乳動物細(xì)胞鈣動員信號事件的重要工具。發(fā)光蛋白的一個主要優(yōu)點是在鈣離子與腔腸素 -發(fā)光蛋白復(fù)合物結(jié)合時立即發(fā)射閃光型發(fā)光。水母發(fā)光蛋白 (aequorin) 檢測的背景信號接近于零，導(dǎo)致高的信號與背景比值。此外，腔腸素氧化發(fā)出的光不依賴于光學(xué)激發(fā)，從而消除了自發(fā)熒光的問題?，F(xiàn)在有許多商業(yè)來源的發(fā)光 蛋白表達(dá)細(xì)胞系，使這項技術(shù)更容易獲 得。這些測定方法在文獻 1 中也有描述以及美國專利6,872,538 和歐洲專利 1,145,002。對專利方法感興趣的用戶可能希望在評估這些專利時咨詢法律顧問。
Molecular Devices 公司的 FlexStation 3多功能微孔板讀板機集成了移液系統(tǒng)，允許實時測量基于熒光和發(fā)光細(xì)胞的檢測方法?？稍趶?fù)合添加之前、期間和之后同時監(jiān) 測多達(dá) 8 ( 96 孔格式 ) 或 16 (384 孔格式 ) 孔?？赏ㄟ^用戶定義的分液高度、化合物加液的速度、試劑源位置以及每次加液的吸頭選擇，很容易對檢測進行優(yōu)化。一次性移液吸頭減少了加液和實驗之間交叉污染的機會，并減少了孔板的死體積 ( 與注射器相比 )，節(jié)省了寶貴的試劑。
來 自 Molecular Devices 公 司 的 FLIPRTetra系統(tǒng)是市場上領(lǐng)先的監(jiān)測 GPCR 和離子通道活性的儀器，并代表了一種可靠和靈活的 HTS/uHTS 解決方案， 用于在藥物發(fā)現(xiàn)過程中早期鑒定前導(dǎo)化合物。
FLIPR Tetra 系統(tǒng)現(xiàn)在具有水母發(fā)光蛋白(aequorin) 選項可用，其中包括一種新的ICCD 相機技術(shù)，優(yōu)化后可用于熒光和發(fā)光檢測。此外，細(xì)胞懸浮系統(tǒng)使該系統(tǒng)能夠以 96、384 和 1536 孔 格式進行貼壁和懸浮細(xì)胞檢測。
本應(yīng)用文獻提供了一個基本方案，用于使用 FlexStation 3 讀板機和帶有 ICCD 像機的 FLIPR Tetra 系統(tǒng)執(zhí)行貼壁的水母發(fā)光蛋白 (aequorin) 檢 測。 這兩種儀器都被用來測定在不同細(xì)胞濃 度下，CHO mitoPhotina/H3 細(xì)胞中 IMETIT 的濃度 - 響應(yīng)。

優(yōu)勢
? 在藥物發(fā)現(xiàn)過程中早期識別前導(dǎo)化合物的靈活的中、高通量解決方案
? FlexStation 3 讀板機允許實時檢測熒光和發(fā)光實驗
? 具有水母發(fā)光蛋白 (aequorin)選項的 FLIPR Tetra 系統(tǒng)，包括一個 ICCD 像機，是為熒光和發(fā)光檢測而優(yōu)化的

材料和方法
? CHO mito-Photina/H3 細(xì)胞 (AxxamSpA)。H3 細(xì)胞系是通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染具有Ga16 和組胺 H3 基因的線粒體膜靶向嵌
合發(fā)光蛋白 photina 的 CHO-K1 細(xì)胞生成的。
? 培養(yǎng)基：含有 15 mM HEPES 的 Dulbecco′sMEM/ Nutrient Mix F12 培 養(yǎng) 基 (Cat.#11039-047), 并 加 入 1.35 mM 丙酮酸鈉 (Cat. #11360-070), 10% FBS(Cat.#10082-147), 1% 青霉素 / 鏈霉素(Cat. #15070-063), 500 μg/mL 遺傳霉素 (Cat. #10131-027) 和 1% L- 谷氨酰胺 (Cat.#25030-081), 以上均來自Invitrogen 公司。
? 無鈣和鎂離子的 PBS(Invitrogen Cat. #14190-144)
? 乙二胺四乙酸鈉 (VERSENE)1:5000(Invitrogen Cat. #15040-066)
? 11 mM 天然腔腸素 (PharmaTech Int.Cat. # 55770-48-1) 儲存液稀釋于 DMSO(Sigma Cat.#D5879) 以及 1mM 谷胱甘肽(Sigma Cat.#G-6529)
? 檢測緩沖液： 含 有 15 mM HEPES(Invitrogen Cat. #11039-047) 的無酚紅DMEM/HAM ′ s F12 培養(yǎng)基 (Invitrogen
Cat. #11039-021) 并加有 0.1% BSA (SigmaCat. #A3294)
? 組胺 H3 激動劑：IMETIT(Sigma Cat. #I-135)
? 384 孔黑壁、底透微孔板(Corning Cat. #3712)
? 帶有 ICCD 選項的 FLIPR Tetra 系統(tǒng)(Molecular Devices)
? FlexStation 3 多功能微孔板讀板機(Molecular Devices)
方法
檢測孔板準(zhǔn)備
為了創(chuàng) 建檢測孔板，用乙二胺四乙酸鈉(VERSENE) 法收集 CHO mito-Photina/H3 細(xì)胞，在沒有選擇性抗生素的情況下重新懸浮于培養(yǎng)基中，并在 25 μL 體系中以不同的細(xì)胞濃度 (625、1250、2500 和5000 細(xì) 胞 / 孔 ) 接種在 384 孔 黑壁、 底透孔板中，在 37 ℃ 和 5% CO2 下 孵育過夜。

從培養(yǎng)箱中取出檢測孔板，移去培養(yǎng)基，替換為含 5 μM 天然腔腸素的 25 μL 檢測緩沖液。加入腔腸素的孔板室溫下黑暗中孵育五分鐘。
化合物板準(zhǔn)備
用聚丙烯 384 孔 板在測定緩沖液中制備2X 濃 度 的 IMETIT，一 種 H3 組胺受體激動劑。
儀器設(shè)置和數(shù)據(jù)分析
腔腸素孵育之后， 檢測孔板置于FlexStation 3 讀板機或 FLIPR Tetra 系統(tǒng)。使用如表 1 參數(shù)的模板已在 SoftMaxPro 軟件 (FlexStation 3) 中準(zhǔn)備完畢，而使用表 2 參數(shù)的模板已在 ScreenWorks軟件中 (FLIPR Tetra) 準(zhǔn)備完畢。
發(fā)光讀數(shù)為 15 秒為給出基線讀數(shù)，然后使用儀器上的移液系統(tǒng)分配不同濃度的特定配體 (IMETIT)，同時監(jiān)測發(fā)光的變化。平均 RLU( Z大 - Z小 )、標(biāo)準(zhǔn)偏差、EC50、EC80處的 Z 因子和濃度響應(yīng)曲線圖的均使用SoftMax Pro 軟件計算得到。SoftMax Pro軟件中已有針對 FlexStation 3 讀板機的水母發(fā)光蛋白檢測的預(yù)設(shè)模板。
結(jié)果
用閃光型發(fā)光法監(jiān)測 mito-Photina/H3 轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞受到 IMETIT 刺激的鈣流。在測定過程中，發(fā)光信號由
FlexStation 3 讀 板 機 和 FLIPR Tetra 系統(tǒng)作為相 對發(fā) 光單位 (RLU) vs 時間來測量。根據(jù) IMETIT 濃度繪制平均RLUs( Z大 - Z小 ) 以生成濃度 - 響應(yīng)曲線 ( 圖 1，F(xiàn)lexStation 3 讀板機數(shù)據(jù)；圖 2，F(xiàn)LIPRTetra 系統(tǒng)數(shù)據(jù) ) 和計算的 EC50 值。IMETIT 的 EC50, EC80 的 Z 因子總結(jié)于表3 和 表 4。FlexStation 3 微孔板讀板機上 的 IMETIT EC50 值范圍從1.81 到 2.67nM， 而 在 帶 有 ICCD 相 機 選 項 的 FLIPRTetra 系統(tǒng)上報道的 The EC50 值在 1.18到 3.00 nM 范圍。兩組結(jié)果均接近公布的EC50 值 3.43 nM。EC80 處 的 Z 因 子 在 兩臺儀器之間同樣具有可比性。

總結(jié)
FlexStation 3 讀板機和具有水母發(fā)光蛋白 (aequorin) 選項 ( ICCD 相機 ) 的 FLIPRTetra 系統(tǒng)已用于對 Photina 貼壁發(fā) 光細(xì)胞實驗的測定。在使 用 FlexStation 3讀板機或具有 ICCD 像機選項 的 FLIPRTetra 系統(tǒng)時，用于貼壁發(fā)光實驗的Photina 細(xì)胞的制備和處理方法是相同的。這連同產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的相關(guān)性，支持使用 FlexStation 3 讀板機進行較低通量的Photina 檢測。此外，該儀器還可用于開發(fā)易于轉(zhuǎn)移到 FLIPR Tetra 系統(tǒng)以進行高通量篩選為目的的檢測。