簡(jiǎn)介
巨噬細(xì)胞起源于血液?jiǎn)魏思?xì)胞，它們離開(kāi)血液循環(huán)，穿透各種組織，在那里分化成巨噬細(xì)胞。它們參與清除病原體和吞噬死亡細(xì)胞。此外，它們通過(guò)釋放細(xì)胞因子來(lái)引發(fā)炎癥反應(yīng)，這些細(xì)胞因子激huoxue管細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞粘附到血管并遷移到組織中。分化的 THP-1 細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的體外模型被廣泛應(yīng)用于巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的研究。人單核細(xì)胞 THP-1 可被佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 (PMA) 誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，并被細(xì)菌脂多糖 (LPS) 激活?；罨?THP-1 細(xì)胞改變形態(tài)并變得更加粘附。它們還會(huì)分泌炎癥細(xì)胞因子，這是 LPS 引發(fā)的細(xì)胞信號(hào)事件級(jí)聯(lián)的結(jié)果。細(xì)胞因子的表達(dá)水平是細(xì)胞炎癥模型的重要生理指標(biāo)。在本文中，我們展示基于 THP-1 細(xì)胞的多參數(shù)測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果。 我們?cè)?ImageXpress Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)上使用表型成像來(lái)評(píng)估細(xì)胞形態(tài)和粘附性。 我們還使用在 Pu·MA 系統(tǒng)上運(yùn)行的低容量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISAs)，并在 SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)上檢測(cè)，以測(cè)量分泌的細(xì)胞因子并評(píng)估化合物對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。多參數(shù)的檢測(cè)工作流程如圖 1 所示。
優(yōu)勢(shì)
? 對(duì)珍貴樣品進(jìn)行多重參數(shù)分析
? 試劑用量減少 5-10 倍，3 小時(shí)內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果
? 自動(dòng)成像觀察巨噬細(xì)胞分化

我們觀察到 THP-1 細(xì)胞經(jīng) PMA 和 LPS 的聯(lián)合刺激，白細(xì)胞介素-8 (IL-8)、白細(xì)胞介素1β (IL-1β) 和腫瘤壞死因子-α (TNFα) 分泌水平增加。為了評(píng)估抗炎化合物的作用，另外用 p38 MAP 激酶 (MAPK) 抑制劑SB202190、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯 (PDTC)及抗生素莫西沙星處理細(xì)胞。SB202190作用于 JAK / STAT 和 NFκB 途徑?？寡趸瘎?PDTC 抑制 NFκB 的活化。莫西沙星通過(guò)抑制 NF-κB，ERK 和 JNK 活化來(lái)抑制IL-8 和 TNFα 的分泌。通過(guò)量化細(xì)胞粘附力、細(xì)胞因子及趨化因子分泌的變化來(lái)評(píng)價(jià)化合物的抗炎作用。所選的化合物導(dǎo)致它們的分泌量呈濃度依賴性下降。對(duì)細(xì)胞形態(tài)和黏附力的影響也通過(guò)細(xì)胞圖像的表型分析來(lái)評(píng)估。
材料
? THP-1 細(xì)胞 (ATCC)
? PMA (Sigma)
? LPS (Sigma)
? SB202190 (Sigma)
? PDTC (Sigma)
? 莫西沙星 (Sigma)
? IL-8，IL-1β 和 TNFα 的 ELISA 抗體對(duì)(BioLegend)
? ImageXpress Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)(Molecular Devices)
? Pu·MA系統(tǒng) ( 蛋白質(zhì)流體學(xué) )
? SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)(Molecular Devices)
方法
? 將 THP-1 細(xì)胞以每孔 20,000 個(gè)細(xì)胞接種于 96 孔微孔板，并孵育 48 小時(shí)。 然后用 PMA 和 LPS ( 0-5 pg / mL PMA 和0-100 pg / mL LPS ) 的混合物刺激它們24 小時(shí)。
? 刺激前兩小時(shí)加入抗炎化合物。
? 孵育后，從每個(gè)孔中取出 60 μL 上清液用于 ELISA。樣品可立即進(jìn)行檢測(cè)分析也可儲(chǔ)存在 -70℃ 下用于后續(xù)分析。
? 上清液在檢測(cè)緩沖液中以 3： 1 稀釋，并使用 Pu·MA 系統(tǒng)流動(dòng)芯片和試劑分析 IL-8，TNFα 和 IL-1β，隨后使用SpectraMax iD5 讀板機(jī)的吸光度模式檢測(cè)結(jié)果。

? 使用 ImageXpress Pico 成像系統(tǒng)的透射光 (TL) 成像細(xì)胞。 通過(guò)用培養(yǎng)基洗滌兩次去除非粘附細(xì)胞，在CellReporterXpressTM 圖像采集和分析軟件中計(jì)數(shù)透射光圖像中的細(xì)胞。
結(jié)果
在用 PMA 和 LPS 刺激后，活化的 THP-1細(xì)胞粘附于平板表面并上調(diào)細(xì)胞因子。 使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)使用透射光對(duì)細(xì)胞成像，以比較刺激前后的細(xì)胞形態(tài)。由 THP-1 細(xì)胞受刺激引起的細(xì)胞表型變化顯示在圖 2 中。細(xì)胞形態(tài)由單核細(xì)胞典型的小、圓、不粘附表型轉(zhuǎn)變?yōu)楦蟆⒏?、更粘附的巨噬?xì)胞表型。用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)和 CellReporterXpress 軟件對(duì)洗去非粘附細(xì)胞后出現(xiàn)的粘附細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行量化。
低體積的 Pu·MA 自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量上清液中響應(yīng)細(xì)胞刺激而分泌的趨化因子 IL-8和細(xì)胞因子 IL-1β 和 TNFα 的濃度。該檢測(cè)系統(tǒng)采用低體積 (10-20 μL) 的上樣量和現(xiàn)有的抗體對(duì)， 這便于我們測(cè)量樣品體積有限的多種分析物。 細(xì)胞刺激引起的趨化因子和細(xì)胞因子分泌增加如圖 3 所示。與未刺激的細(xì)胞相比，IL-8 的水平增加 30倍， IL-1β 增加 6 倍，TNFα 在刺激的細(xì)胞中增加 15 倍。
我們觀察到幾種抗炎化合物對(duì)受刺激的THP-1 細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，粘附和 IL-8 分泌的影響。 使用 ImageXpress Pico 成像系統(tǒng)對(duì)由抗炎化合物引起的細(xì)胞形態(tài)的變化進(jìn)行成像 ( 圖 4 ) 。為了評(píng)價(jià)抗炎反應(yīng)中細(xì)胞粘附的變化，我們通過(guò)圖像分析確定洗滌之前和之后存在的貼壁細(xì)胞的數(shù)量。使用 CellReporterXpress 軟件對(duì)圖像中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SoftMax Pro 軟件，通過(guò) 4 參數(shù)曲線擬合計(jì)算出 EC50 值。然后用 Pu·MA 系統(tǒng)和 SpectraMax iD5 讀板機(jī)檢測(cè)來(lái)自這些細(xì)胞的上清液，以確定抗炎化合物對(duì)趨化因子 IL-8 分泌的影響。經(jīng) SB202190、PDTC 和莫西沙星處理后，細(xì)胞中 IL-8 分泌量呈濃度依賴性下降，并導(dǎo)致粘附細(xì)胞數(shù)量減少 ( 圖 5 )。 使用 4-參數(shù)曲線擬合計(jì)算得出的 EC50 值顯示在表 1中。

結(jié)論
我們展現(xiàn)了一種多重參數(shù)的炎癥檢測(cè)方法，該方法采用 THP-1 炎癥細(xì)胞模型，聯(lián)合使用 ImageXpress Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)、Pu·MA 新型低體積自動(dòng) ELISA 檢測(cè)系統(tǒng)和SpectraMax iD5 多功能讀板機(jī)進(jìn)行測(cè)定。ImageXpress Pico 系統(tǒng)對(duì)處理過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行透射光成像，隨后 CellReporterXpress軟件對(duì)響應(yīng)刺激而粘附的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。Pu·MA 系統(tǒng)使用微流控芯片和 ELISA 抗體對(duì)技術(shù)進(jìn)行免疫分析，該微流控芯片可將試劑使用量減少 5-10 倍，且在不到 3 小時(shí)內(nèi)提供結(jié)果。在 SpectraMax iD5 讀板機(jī)上檢測(cè) ELISA 結(jié)果，并使用 SoftMax Pro軟件分析數(shù)據(jù)。使用以上的工作流程，我們同時(shí)監(jiān)測(cè)了響應(yīng)三種抗炎化合物的趨化因子和細(xì)胞因子（ IL-8，IL-1β 和 TNFα ）表達(dá)水平。 觀測(cè)到的趨化因子和細(xì)胞因子水平的差異與已發(fā)表的作用機(jī)制一致。