介紹
在葡萄酒生產(chǎn)過程中，檢測蘋果酸、殘留糖、揮發(fā)酸和氨的水平是質(zhì)量控制非常重要的指標(biāo)。酶檢測采用微孔板進(jìn)行，可定量并提高通量，從而節(jié)省時間和人力。殘留糖測定涉及到分析物的酶轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生副產(chǎn)物 NADPH。測定 NADPH的 量，通過340 nm下光吸收檢測，可以直接定量葡萄酒中待測物。下面我們介紹如何使用Molecular Devices 的 SpectraMax Plus384 微孔板讀板機(jī)和 SoftMax Pro 軟件高效收集和分析酶檢測葡萄酒中殘留糖的方法。SpectraMax Plus 384 微孔板讀板機(jī)優(yōu)勢：
? 波長范圍：190-1000 nm，1 nm 步進(jìn)，無需加購濾光片，波長涵蓋 UV
? 讀板速度：96 孔板：5 s；384 孔板，16 s
? 溫控：室溫 +4 ℃ ~ 45 ℃
? 比色皿功能：可用標(biāo)準(zhǔn)比色皿，12 × 75mm 比色皿
? OD檢測范圍：0-4 OD

葡萄酒中殘留糖 (RS) 的酶檢測酶反應(yīng)：
優(yōu)勢
? 與傳統(tǒng)的比色皿方法相比，提高了通量
? 使用 SoftMax Pro 軟件進(jìn)行自動數(shù)據(jù)分析
? PathCheck 傳感器用于微孔板孔中的吸光度讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化
HK：己糖激酶
PGI：磷酸葡萄糖異構(gòu)酶
G6P-DH：6-磷酸葡萄糖脫氫酶
反應(yīng)動力學(xué)
本實(shí)驗(yàn)主要檢測葡萄酒中兩種主要的糖，葡萄糖和果糖。自從 NADPH 能夠用與其相關(guān)的 6-磷酸葡萄糖計(jì)量，我們就可以通過檢測 340 nm 下葡萄糖 + 果糖的量來代表 NADPH。
PathCheck 功能
PathCheck 是 Molecualr Devices 公司特有技術(shù)，用來檢測微孔板中樣品的光程。該創(chuàng)新方法可將微孔板檢測的光吸收值轉(zhuǎn)化成 1 cm 標(biāo)準(zhǔn)比色皿的。朗伯-比爾定律
A = E*C*L
E = 吸收率 ( 消光系數(shù) )
C = 濃度

圖 1 SpectraMax Plus 384 光學(xué)構(gòu)造(1)Glucose + ATP (HK) Glucose-6-Phosphate + ADP(2)Fructose + ATP (HK) Fructose-6-Phosphate + ADP(3)Fructose-6-phosphate (PGI)Glucose-6-Phosphate(4)Glucose-6-phosphate + NADP(G6P-DH)Glucose acid-6-phosphate+ NADPH + H+

L = 光程
如果使用比色皿，光程是水平的，因此固定是 1 cm。但是如果使用微孔板，光程是垂直的。所以，光程取決于樣本體積，見圖 2。
SoftMax Pro 軟件
該軟件控制儀器，采集數(shù)據(jù)并提供完整的數(shù)據(jù)分析。特定儀器設(shè)置和計(jì)算公式能預(yù)先保存成客戶自定義的方法。操作員可以直接打開預(yù)設(shè)方法，讀板后即可得到完整的計(jì)算分析結(jié)果。
材料
? SpectraMax Plus 384 微孔板讀板機(jī)(Molecular Devices cat. #PLUS 384)
? 紫外透 96 孔板 (Corning cat. #3635)
? 移液器( Drummond Scientific cat. #2704174,2705402, 2705412, 2704180; Drummond 數(shù)字微量分液器 cat. #3-000-510 )
? 移液器吸頭(Eppendorf cat. # epT.I.P.S. Reloads022491539, 022491512, 022491547)
? 離心機(jī) (Eppendorf cat. #5424)
? 1.5 mL 離心管(Eppendorf cat. #022364111, 022363557,022363514, 2236357-3)
? D-果糖 (Fisher Scientific cat. #L95-500)
? 己糖激酶/6-磷酸葡萄糖脫氫酶 30 mg(10 mL, Roche cat. #10737275001)
? 磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 10 mg/mL(Roche cat. #10128139001)
? 聚烯吡酮(Fisher Scientific cat. #BP431-100)
? TRIS (Amresco cat. #0497-500G)
? MgSO4?7H2O(Fisher Scientific cat. #M63-500)
? ATP (Boehringer Mannheim cat.#10519987001)
? NADP (Boerhringer Mannheim cat.#10240354001)
? 1.0M HCl(Fisher Scientific cat. #SA431-500)

果糖標(biāo)準(zhǔn)品的制備
混勻試劑，直至完全溶解。標(biāo)準(zhǔn)品存儲在1.5 m 凍存管中，-4 ℃ 保存，做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定系數(shù) R = 1.000。如果試劑放置太久，可能導(dǎo)致無法做出理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
RS緩沖液的制備
聚烯吡酮 (PVP) 2.0 g，TRIS 3.0 g 和MgSO4?7H2O 0.5 g 加入至 350 mL 去離子水中，用 1.0 M HCl (≈36 mL) 調(diào)節(jié) PH 至7.6。然后，加入 0.15 g ATP 和 0.175 gNADP，容量瓶定容至 500 mL。配置好的緩沖液存儲于 4 ℃。
RS 分析中葡萄酒樣品的制備
如果需要，葡萄酒樣品按照表 2 用去離子水稀釋。渾濁樣品在稀釋前或稀釋后離心或過濾后待用。
樣品用去離子水 1：10 稀釋，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)稀釋 1：10 至 4.0 g / 100 mL。樣品用去離子水 1：100 稀釋，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)稀釋 1：100 至 10.0 g / 100 mL。
方法
第一步：空白對照，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做重復(fù)

第二步：從冰箱中取出 D-果糖，室溫融化
第三步：取出分析所需體積的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品緩沖液至室溫，燒杯上標(biāo)記“RS”。這步對獲得理想的確定系數(shù)非常關(guān)鍵。
第四步：磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 (PGI) 按照表 3加入緩沖液中。PGI 需要與緩沖液完全混合，但必須輕柔以防酶變性。
第五步：用排槍將 300 μL 緩沖液加入至每孔。
第六步：在相應(yīng)孔中加入 5 μL 去離子水，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品。
第七步：槍頭上下混勻試劑。
第八步：微孔板振蕩混勻 30 s；然后用微孔板讀板機(jī)進(jìn)行初次光吸收讀板

第九步：初次讀板后，立刻用 1-20 μL 排槍往每孔加入 5 μL HK / G6P-DH。
第十步：微孔板振蕩混勻 30 s，室溫孵育21 分鐘。
第十一步：21 分鐘孵育結(jié)束后，在微孔板讀板機(jī)上采用同樣的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行Z終讀板。
儀器參數(shù)設(shè)置
儀器通過 SoftMax Pro 軟件控制。參數(shù)設(shè)置按照圖 4 在軟件上完成。表 4 顯示的是RS 分析的儀器參數(shù)設(shè)置。圖 4 是波長設(shè)置和“PathCheck”選項(xiàng)設(shè)置的截屏。創(chuàng)建 2 個相同的參數(shù)設(shè)置。初始板部分包括除了酶以外的所有試劑。第二塊板部分是加入酶后的實(shí)際反應(yīng)結(jié)果。通過 reduction 的設(shè)置，用加酶后光密度值減去初始值。
RS分析孔板定義
軟件中的孔板定義是為了在微孔板中標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的對應(yīng)孔位置。靈活的孔板定義方式，能夠輕松設(shè)置多個樣品和重復(fù)。初始板中，無需孔板定義。Z終板中，定義標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品的位置。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度通過點(diǎn)擊該孔進(jìn)行設(shè)置，輸入相應(yīng)濃度。濃度范圍是 0-0.4 g / 100 mL ( 圖5 )。
Reduction設(shè)置
Z終板是酶實(shí)際反應(yīng)后的結(jié)果。Reduction 設(shè)置 ( 圖 6 )，用Z終板的光密度值減去初始板的。因此無需使用板空白。板空白已合并入實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制中。

結(jié)果
實(shí)驗(yàn)操作見材料和方法中的描述?？装逯邪ǔ敢酝獾乃性噭┳x板的結(jié)果作為基線 ( 圖 7，A )。加入酶后混勻，并室溫放置 21 分鐘后讀出Z終讀數(shù) ( 圖 7，B )。SoftMax Pro 軟件自動計(jì)算并在相應(yīng)分組中顯示出標(biāo)準(zhǔn)品的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差和 %CV ( 圖 8 )。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)曲線通過“STD”分組的結(jié)果繪制出， x 軸是濃度，y 軸是 OD 值的平均值( 圖 9 )。標(biāo)準(zhǔn)偏差作為誤差線，用線性方程擬合。標(biāo)準(zhǔn)曲線用來計(jì)算葡萄酒樣品中標(biāo)記為“Unknown”組樣品的殘留糖濃度。
模板中指定為“未知”的樣本數(shù)據(jù)自動填充為“未知”組部分。每個樣品的殘留糖都是通過軟件中標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距計(jì)算出來的 ( 圖 10 和 11 )。

結(jié)論
SpectraMax Plus 384 微孔板讀板機(jī)是通過酶定量分析葡萄酒中殘留糖 (RS) 和蘋果酸 (ML) 的Z佳選擇，同樣也能應(yīng)用在其他相似分析上，如氨和揮發(fā)酸的檢測。
優(yōu)勢如下：
? 經(jīng)濟(jì)且省時
? SpectraMax Plus 384 具有波長靈活和PathCheck 功能，能幫助實(shí)驗(yàn)獲得更精
確和準(zhǔn)確的結(jié)果
? SoftMax Pro 軟件在分析和計(jì)算復(fù)雜且數(shù)據(jù)多的結(jié)果時非常方便。它能夠預(yù)設(shè)模板，即開即用的方法，用戶自定義公
式和多樣的圖表選擇
? 其他 Molecular Devices 具有光吸收檢測功能的微孔板讀板機(jī)，如：SpectraMaxi3x 多功能微孔板讀板機(jī)，也能進(jìn)行該應(yīng)用分析
? 針對高通量需求，Molecualr DevicesStakMax 微孔板堆板機(jī)系統(tǒng)能夠整合SpectraMax 微孔板讀板機(jī)，進(jìn)行 20、
40 和 50 塊板的自動進(jìn)樣。