簡介
新冠病毒的出現(xiàn)導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的新冠大流行，為了理解病毒的發(fā)病機(jī)理并開發(fā)疫苗，亟需快速開發(fā)多種研究工具。檢測病毒感染和疫苗接種后的免疫反應(yīng)對新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗體是免疫反應(yīng)和疫苗效價的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監(jiān)測有效性的重要參數(shù)。
人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統(tǒng)方法例如蝕斑減少中和試驗 (PRNT) 來檢測。然而，該方法使用活的、具備感染性的病毒加入到靶細(xì)胞中，所以需要生物安全三級實驗室以及耗時費(fèi)力的細(xì)胞培養(yǎng)。數(shù)據(jù)結(jié)果的分析耗費(fèi)時間并且不能自動化。此外，假病毒中和試驗 (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級實驗室完成，但此方法需要細(xì)胞培養(yǎng)和熒光成像來測得中和抗體活性，因此，也不適用于樣品的高通量篩選。
此 GeneScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒采用免病毒中和測試法 (sVNT) 來克服傳統(tǒng)的病毒中和實驗的缺點(diǎn)。它采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 的模式，如圖 1 和圖 2 所示。

優(yōu)勢
? 快速、簡單的 ELISA 實驗流程設(shè)置
? 無需三級實驗室或細(xì)胞培養(yǎng)
? 實驗結(jié)果與蝕斑減少中和試驗數(shù)據(jù)一致

刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域的 HRP 偶聯(lián)片段與含有中和性抗體的患者血清樣本相結(jié)合。此混合物加入到已被 ACE2 受體包被的 ELISA 孔板中。如果樣品中的抗體有中和抗體的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的結(jié)合將被打破，隨后清 洗，移除HRP-RBD。使用光吸收微孔板讀板機(jī)測量產(chǎn)生的信號，在中和抗體存在的情況下，此信號會更低，將此信號與實驗對照組的信號進(jìn)行比較，可以評估待測樣本中存在的中和抗體活性。

刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域的 HRP 偶聯(lián)片段與含有中和性抗體的患者血清樣本相結(jié)合。此混合物加入到已被 ACE2 受體包被的 ELISA 孔板中。如果樣品中的抗體有中和抗體的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的 結(jié)合將會被打破，隨后清 洗，移除HRP-RBD。使用光吸收微孔板讀板機(jī)測量產(chǎn)生的信號，在中和抗體存在的情況下，此信號會更低，將此信號與實驗對照組的信號進(jìn)行比較，可以評估待測樣本中存在的中和抗體活性。

圖 2 新冠病毒 sVNT 檢測方法。 此實驗使用 ELISA 模式，在待測樣本中通過中和性的抗體能夠檢測 RBD 與 ACE2 結(jié)合的擾動。

材料
? GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒 (GenScript cat. #L00847-A)，
? 10 份血清樣本，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗體陽性，
? 3 份血清樣本，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗體陰性，
? MultiWash+ 微孔板洗板機(jī) (Molecular Devices)
? 光吸收檢測模式用到的 Molecular Devices 酶標(biāo)儀：
? SpectraMax ABS Plus 酶標(biāo)儀
? SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀
? SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀
? SpectraMax M5e 多功能酶標(biāo)儀
方法
在實驗開始前，試劑盒的所有組分和待測樣本可放置于室溫。試劑盒中的試劑需要按如下操作稀釋：
? 用去離子水稀釋 20x 儲液得到 1x wash，
? 用 HRP 稀釋緩沖液按 1:1000 比例稀釋 HRP-RBD 儲液得到HRP-RBD 工作液。
待測樣本 和實驗對照組分別與 HRP 偶聯(lián)的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測樣本、陽性對照、陰性對照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +120uL 稀釋后的待測樣品或?qū)φ掌?。此混合物?37 度孵育15 分鐘。分別添加 100uL 的陽性對照混合物、陰性對照混合物、待測樣品混合物至實驗復(fù)孔中。然后封蓋，在 37 度孵育 15 分鐘。使用 MultiWash+ 洗板機(jī)和 1x wash 溶液清洗所有的微孔板，每次每孔 300 uL，橫向吸液。然后，100uL TMB 溶液加入到每個孔中，封蓋，避光，室溫孵育 15 分鐘。與 TMB 底物孵育后，50 uL 終止溶液加入到每個孔中，立即在多款酶標(biāo)儀上測讀，光吸收波長設(shè)置為 450 nm。實驗結(jié)果的有效性評估看陰性對照的 OD450 值是否大于 1.0，陽性對照的值是否小于 0.3。如果不符合這些標(biāo)準(zhǔn)，實驗結(jié)果無效，需要重復(fù)試驗。
各個待測樣本的百分比抑制值按如下公式計算：

表 1 的卡值被用來說明樣本的結(jié)果是陽性還是陰性，是否存在可檢測到的新冠中和抗體。表中的卡值來源于新冠 sVNT試劑盒手冊。對于不同地區(qū)和種族背景，使用者可以直接基于具有代表性的患者血清樣本設(shè)置卡值。

結(jié)果
使用陽性和陰性對照評估實驗結(jié)果的質(zhì)量。如表 2 所示，陰性對照的 OD450 值大于 1.0，陽性對照的 OD450 值小于 0.3，這是根據(jù) sVNT 試劑盒的質(zhì)量控制要求而定。

表 2，陰性對照的 OD450 值大于 1.0，陽性對照的 OD450 值小于 0.3，驗證了實驗結(jié)果。 對照組做一次重復(fù)實驗，變異系數(shù) CV 值小于 30% 是可重現(xiàn)的。
如方法中所描述，待測樣本和陰性對照的 OD450 值用于計算百分比抑制值?；谠噭┖惺謨灾幸话愕目ㄖ堤攸c(diǎn)，百分比抑制值大于等于 30% 說明檢測到新冠中和抗體，呈陽性；百分比抑制值小于 30% 說明未檢測到新冠中和抗體，呈陰性。在PRNT 中和活性檢測中呈陰性的三個樣品，在 sVNT 檢測中也呈陰性。同樣地，在 PRNT 中和活性檢測中呈陽性的十個樣品，在 sVNT 檢測中也呈陽性 ( 如表 3)。

表 3 先前測得的多個樣品的百分比抑制值和陽性、陰性結(jié)果。 使用SpectraMax ABS Plus 獲得表中所示的實驗結(jié)果，其他類型的酶標(biāo)儀也獲得相同的結(jié)果。
結(jié)論
此 GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒數(shù)據(jù)來源于一組患者血清樣本，與傳統(tǒng)的、耗時費(fèi)力的 PRNT 方法獲得的數(shù)據(jù)吻合。此 sVNT 試劑盒提供了易于使用的試劑和緊湊的 ELISA 工作流程，大約 1 小時能夠完成。其中必需的一步清洗操作由MultiWash+ 洗板機(jī)完成，節(jié)約了寶貴的時間。SpectraMax 讀板機(jī)和 SoftMax Pro 軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠運(yùn)用實驗特異的方案進(jìn)行分析，設(shè)置公式可以應(yīng)用于所需的計算和自動結(jié)果輸出。