在COVID-19大肆流行的當(dāng)下，截至目前為止，全 球已超過5.6億人次感染，并導(dǎo)致超過637萬人死亡。因此針對(duì)SARS-CoV-2中和抗體的快速開發(fā)尤為重要。在抗體開發(fā)過程中，中和抗體篩選實(shí)驗(yàn)常用的細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)（Cytopathic effect，CPE），指由病毒感染引起的宿主細(xì)胞的活率和形態(tài)變化，主要觀察的CPE包括細(xì)胞的腫脹皺縮，變圓，裂解，脫落，形成蝕斑和聚團(tuán)等。傳統(tǒng)的CPE檢測(cè)通常依靠顯微鏡下的肉眼觀察，數(shù)據(jù)記錄困難。同時(shí)傳統(tǒng)CPE數(shù)據(jù)分析需要經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員進(jìn)行人工鑒定，耗費(fèi)時(shí)間精力，而且很難避免人為導(dǎo)致的主觀判斷差異。

安捷倫xCELLigence 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（Real-time cell analysis，RTCA）可靈敏的捕獲到細(xì)胞活率和形態(tài)的變化，可在數(shù)天內(nèi)持續(xù)跟蹤病毒致CPE，體外單克隆抗體中和測(cè)定使用RTCA能夠?qū)Σ《靖腥炯?xì)胞中的CPE 進(jìn)行高通量、定量動(dòng)力學(xué)測(cè)量。

2022年6月17日，美國范德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心在CELL旗下的STAR PROTOCOLS雜志發(fā)表了題為“Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape”的研究方案論文。該文章為我們?cè)敿?xì)介紹了一種用于評(píng)估抗體中和的RTCA 方法，描述了如何評(píng)估單克隆抗體(mAb) 的中和效力，并鑒定對(duì)中和抗體逃逸的病毒突變體。在此之前，該團(tuán)隊(duì)已經(jīng)應(yīng)用RTCA作為高通量中和抗體篩選手段在多個(gè)頂 級(jí)期刊發(fā)表多個(gè)高水平文章。

該研究詳細(xì)描述了基于 RTCA 的工作流程體外單克隆抗體對(duì)病毒的中和測(cè)定和鑒定表達(dá)SARS-CoV-2 刺突蛋白的可復(fù)制的重組水泡性口炎病毒(rVSV-SARS-CoV-2) 的逃逸突變體[1,2]（圖1）。基于RTCA的中和作用檢測(cè)是通過測(cè)量由病毒感染細(xì)胞單層引起的細(xì)胞阻抗變化，Z 終結(jié)果顯示為細(xì)胞指數(shù)的變化（Cell index, CI）。

不局限于SARS-CoV-2病毒中和抗體的研究，該團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用RTCA已經(jīng)在埃博拉病毒、寨卡病毒、流感病毒和尼帕病毒中和抗體的識(shí)別和表征方面取得了很多優(yōu)異的結(jié)果[3-7]。

在這一實(shí)驗(yàn)方案中，首先利用RTCA進(jìn)行病毒滴定，梯度稀釋rVSV-SARS-CoV-2病毒并在RTCA上進(jìn)行Vero CCL81細(xì)胞的CPE實(shí)驗(yàn)，Z 終選擇加入病毒后40h內(nèi)達(dá)到完全CPE的1：160的稀釋比例進(jìn)行后續(xù)中和抗體實(shí)驗(yàn)（圖2）。然后RTCA抗體的中和實(shí)驗(yàn)將需要測(cè)試的抗體以及對(duì)照抗體進(jìn)行梯度稀釋（圖3.A），與病毒混合后加入到單層Vero CCL81細(xì)胞中在RTCA上進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，Z 終結(jié)果使用非線性擬合和可變斜率分析計(jì)算抗體的RTCA IC50值以呈現(xiàn)mAb的中和曲線（圖4）。

該研究也同時(shí)描述了病毒變體篩選實(shí)驗(yàn)方案，與抗體中和實(shí)驗(yàn)不同，該實(shí)驗(yàn)使用10倍過量病毒，且單一濃度的抗體，同樣應(yīng)用RTCA進(jìn)行長期的觀察來區(qū)分病毒直接引起的CPE和中和抗體引起的延遲CPE以識(shí)別逃逸的突變病毒（圖5.A）。為了驗(yàn)證逃逸的病毒，收集逃逸孔中的病毒，在隨后的RTCA 實(shí)驗(yàn)中，不同mAb在高濃度（比飽和中和濃度高兩倍）情況下重新評(píng)估分離的病毒，參見圖5B。將逃逸的病毒分離并在六孔板中進(jìn)行繁殖，后續(xù)進(jìn)行病毒RNA提取以及建庫進(jìn)行測(cè)序，從而鑒定出病毒的突變位點(diǎn)。

總結(jié)：通過該方案，可以高效的鑒定出SARS-CoV-2的中和抗體，并快速的鑒定和分離出抗體逃逸的突變毒株。其中，RTCA作為一種高通量的技術(shù)不僅可以在48-72長時(shí)間實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體的中和，其結(jié)果與傳統(tǒng)方法也高度一致[5]。

目前傳統(tǒng)的病毒中和抗體的篩選方法多基于觀察法，但是該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，數(shù)據(jù)記錄困難，特別不適用于高通量的篩選工作。安捷倫xCELLigence RTCA無需對(duì)細(xì)胞做任何標(biāo)記就可以實(shí)時(shí)分析細(xì)胞的生長，全程自動(dòng)檢測(cè)病毒感染細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)變化，Z 大程度減少了手動(dòng)樣品處理，提升實(shí)驗(yàn)效率，準(zhǔn)確性和重復(fù)性。其中xCELLigence RTCA HT 與xCELLigence RTCA MP 分別配備384 well和6*96 well的通量，滿足高通量需求，簡化篩選工作，同時(shí)保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定輸出。