介紹
生物研究和藥物發(fā)現(xiàn)越來越需要擴大基于細胞的檢測方法的多樣性和復(fù)雜性?；罴毎麢z測可以實時監(jiān)測細胞反應(yīng)，并提供關(guān)于化合物治療效果和生物復(fù)雜性的重要見解。我們使用 ImageXpress Pico 自動細胞成像系統(tǒng)進行實時定量細胞成像分析，以監(jiān)測細胞模型中anticancer化合物的復(fù)雜效果。
為了描述anticancer化合物的作用，我們監(jiān)測了HeLa 宮頸癌細胞增殖和細胞周期的時間依賴效應(yīng)。環(huán)境控制 (EC) 室用于提供所需的CO2 和 O2 濃度。采用透射光延時成像技術(shù)對細胞數(shù)量、融合度、細胞面積進行量化，采用熒光標記技術(shù)評價化合物處理對細胞周期的影響。
使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)結(jié)合 CellReporterXpress 成像采集和分析軟件進行細胞檢測。該成像設(shè)備提供五個熒光通道加上透射光 (brightfield) 以及比色成像。環(huán)境控制室和高精度自動移動臺支持長時間、延時顯微成像技術(shù)，可自動監(jiān)測細胞增殖、分化、化合物毒性和各種其他基于細胞的檢測。

方法
環(huán)境控制和延時監(jiān)測

ImageXpress Pico 系統(tǒng)配備了一個環(huán)境控制室，可以控制和監(jiān)控溫度、CO2 和 O2 濃度以及濕度。與延時成像相結(jié)合，它提供了一個有效的工具進行現(xiàn)場實驗，包括缺氧條件。
細胞培養(yǎng)
HeLa 細胞 ( 取自 ATCC ) 以每孔 3000 個細胞的密度培養(yǎng)在 384 孔黑色透明底微孔板 (Corning, #3663)，在 37℃ 和 4% CO2的環(huán)境控制室中培養(yǎng) 24 小時?；衔锾幚?4 小時，如圖 1-4 所示。穩(wěn)定表達組蛋白mCherry-H2B 和 Tubulin-GFP 的 HeLa細胞由 Málnási-Csizmadia 博士提供，并與正常 HeLa 細胞進行類似的培養(yǎng)和處理。

優(yōu)勢
? 通過環(huán)境控制和延時成像進行活細胞實驗
? 實時監(jiān)測細胞分裂及化合物效應(yīng)評估
? 輕松導(dǎo)出延時數(shù)據(jù)到 MP4 格式，并保存為視頻

圖 1 利用透射光照明，用 10X 物鏡拍攝 HeLa 細胞的圖像。 細胞計數(shù)的分析掩模顯示為白色疊加( 占整個圖像的 20% )。重要的是由于分析 protocol 無法修改或調(diào)整，因此在圖像采集過程中需要對 protocol 進行優(yōu)化。通常曝光時間在 1-6 毫秒范圍內(nèi)，而對焦偏移量通常為 -8。

細胞成像
為了使細胞成像結(jié)果可視化，并監(jiān)測細胞增殖和細胞死亡，在 24 小時內(nèi)，每隔 1 至2 小時用透射光 10X 物鏡獲取圖像。在圖像采集過程中使用透射光細胞計數(shù)通用分析 protoco (Transmitted light cell countgeneral analysis) 進行圖像分析。分析提供了細胞數(shù)量、平均細胞面積和總細胞覆蓋面積的測量。
結(jié)果
利用透射光細胞計數(shù)評估化合物對細胞活力和增殖的影響
通過獲取延時圖像，監(jiān)測細胞培養(yǎng)的表型變化。用透射光或熒光標記物在 EC 室中對細胞進行 24 小時以上的監(jiān)測。將細胞分別鋪到 96 孔或 384 孔板中，每孔分別為12,000 細胞或 3,000 細胞。使用 10X 物鏡，每隔一至兩小時采集一次透射光圖像，連續(xù) 24 小時，96 孔板中每孔成像 4個位點， 384 孔板中每孔成像 1 個位點。在圖像采集過程中進行自動圖像分析。圖像分析包括在透射光下尋找細胞，計數(shù)細胞數(shù)量、單個細胞面積、細胞覆蓋面積 ( 圖1 )。根據(jù)大小和形狀識別死亡細胞，以區(qū)分出健康細胞的分析。用繪圖工具觀察細胞增殖的動力學曲線。圖 2 顯示了 96 孔板中每孔細胞數(shù)隨時間的增加，以此作為增殖的指示。
利用透射光成像和分析方法對anticancer化合物的作用時間進行了評價。通過連續(xù) 24 小時每兩小時采集一次活細胞圖像，觀察化合物效應(yīng)對細胞增殖的影響。觀察星孢菌素和絲裂霉素 C 對細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性 ( 圖 3 )。為了表征化合物效應(yīng)，利用 SoftMaxPro 軟件中的 4 參數(shù)曲線擬合算法計算出抑制細胞增殖 ( 細胞數(shù)量減少 ) 的化合物 EC50 值 ( 圖 3B )。

圖 2 在 24 小時內(nèi)實時監(jiān)測細胞增殖和化合物效應(yīng)。 細胞培養(yǎng)在 96 孔或 384 孔板中，并放置在 EC室。利用 10X 物鏡，每 1-2 小時采集透射光圖像，96 孔板每孔 4 個視野，384 孔板每孔 1 個視野。在采集過程中進行自動圖像分析。注意當使用 IX-Pico 環(huán)境控制室時沒有邊緣效應(yīng)

圖 3 細胞增殖和細胞數(shù)量濃度依賴性變化的時間進程。(A) 時間進程數(shù)據(jù)可視化顯示了對照孔和用增加的指示化合物濃度 ( 重復(fù)孔 ) 處理的孔的細胞計數(shù)。 (B) 24 小時濃度依賴性檢測結(jié)果：絲裂霉素C (紅色；IC50 0.27 μM), 以及 星孢菌素 ( 綠色；IC50 0.05 μM )
利用熒光標記實時識別有絲分裂細胞
我們監(jiān)測了穩(wěn)定表達組蛋白 mCherry?H2B和 Tubulin-GFP 的 HeLa 細胞的分裂。通過使用熒光標記的組蛋白和細胞骨架蛋白，可以跟蹤單個細胞在細胞周期中的進展。圖4顯示了 5 個細胞，每個細胞在 12小時內(nèi)分裂。細胞間橋和形成的紡錘體是可見的 ( 白色箭頭 )。核小而明亮的有絲分裂細胞可以通過圖像分析來識別。計數(shù)所有細胞核 ( H2B-mCherry ) 和 GFP 染色面積 (tubulin) 也可以監(jiān)測細胞總數(shù)和細胞擴散 ( 圖 4B )。

圖 4 有絲分裂細胞的活細胞檢測。 圖像系列顯示 HeLa 細胞穩(wěn)定表達 mCherry-H2B, Tubulin-GFP，正在進行細胞分裂。用箭頭表示有絲分裂細胞，在 10X 物鏡、FITC 和 TRITC 光照下，每 2 小時采集一次圖像，持續(xù) 25 小時。通過計算有絲分裂細胞總數(shù)與有絲分裂細胞數(shù)的比值，可以計算出有絲分裂細胞的百分比(%)
結(jié)論
總的來說，我們的研究結(jié)果證明了環(huán)境控制室和活細胞延時成像技術(shù)可以用于實時監(jiān)測細胞分裂和評估化合物效應(yīng)。在實驗過程中，On the fly 即時分析的圖像分析提供了細胞培養(yǎng)和細胞表型變化的自動監(jiān)測。Z后延時數(shù)據(jù)可以很容易地導(dǎo)出為MP4 格式，并保存為視頻。