氯丙醇酯污染是近年來國際上出現(xiàn)的食品安全熱點問題之一，氯丙醇酯是氯丙醇類化合物與脂肪酸的酯化產(chǎn)物，食品中檢出量較高的是3-氯丙醇酯。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在谷物、咖啡、魚、肉制品、馬鈴薯、堅果和以植物油為原料的熱加工油脂食品中都有3-氯丙醇酯檢出。尤其精煉植物油等食品中檢出3-氯丙醇酯的報道逐漸增加?？s水甘油酯是脂肪酸與縮水甘油的酯化產(chǎn)物，它與氯丙醇酯是一對孿生兄弟，形成機理相似。在油脂精煉過程中，縮水甘油酯通常會伴隨3-氯丙醇酯一起形成，3-氯丙醇酯含量高，縮水甘油酯含量也高。3-MCPD可損害腎臟和生殖系統(tǒng)等，國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將游離態(tài)3-MCPD列入2B類致癌物清單，將游離態(tài)縮水甘油列入2A類致癌物清單。

安譜實驗和南京海關(guān)動植物與食品檢測中心共同合作，參照國際標準“ISO 18363-4:2021”和國標征求意見稿“GB 5009.191-×××× 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定”第二篇第 一法，并對方法進行優(yōu)化，使用快速堿水解方法進行酯鍵斷裂，苯基硼酸進行衍生，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行檢測，內(nèi)標法進行定量，對不同植物油中的氯丙醇酯和縮水甘油酯的含量進行了檢測，方法操作簡便，回收率高，精密度好。

目前安譜實驗與南京海關(guān)動植物與食品檢測中心已建立戰(zhàn)略合作伙伴關(guān)系。近年來，雙方已在科研項目、技術(shù)服務(wù)、培訓(xùn)合作、能力驗證等多個層面展開合作。南京海關(guān)動植物與食品檢測中心是隸屬于南京海關(guān)的獨立法人第三方事業(yè)單位，主要承擔進出境食品、化妝品、動植物及其產(chǎn)品的法定檢驗、檢測、檢疫工作。在食品領(lǐng)域檢測能力卓 越，獲得國家CNAS認可、CMA資質(zhì)認定和CNAS能力驗證計劃提供者等國內(nèi)外權(quán)威資質(zhì)。目前南京海關(guān)動植物與食品檢測中心已完全具備食品中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測能力，并積累了多種基質(zhì)的檢測經(jīng)驗。

一、原理

試樣中加入同位素內(nèi)標，用甲醇鈉溶液進行酯鍵斷裂反應(yīng)，3-氯-1,2-丙二醇酯、2-氯-1,3-丙二醇酯和縮水甘油酯分別轉(zhuǎn)化為游離態(tài)3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、縮水甘油（Gly）和相應(yīng)的脂肪酸甲酯；以酸性溴化鈉溶液進行中和，生成的縮水甘油轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）；試液經(jīng)凈化去除脂肪酸甲酯等雜質(zhì)后，進行苯基硼酸衍生，以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，內(nèi)標法定量。

酯鍵斷裂反應(yīng)中，生成的游離態(tài)3-MCPD在堿性條件下會部分轉(zhuǎn)化成縮水甘油，經(jīng)酸性溴化鈉溶液作用生成3-MBPD；同位素13C3-3-MCPD在相同條件下轉(zhuǎn)化成13C3-3-MBPD的比例和3-MCPD轉(zhuǎn)化成3-MBPD的比例一致，通過轉(zhuǎn)換關(guān)系對試液中總縮水甘油含量進行修正，得到試樣中縮水甘油酯含量。

二、標準品

實驗用到的標準品信息見下表：

表1 標準品信息

1、標準品溶液配置

混合標準儲備液（3-MCPD:54.7 μg/mL，2-MCPD:49.7 μg/mL，Gly:57.8 μg/mL）：準確稱取5.81 mg 3-MCPD-PP、5.79 mg 2-MCPD-SS和4.88 mg GLy-P于20 mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混勻。

混合標準工作溶液I（3-MCPD:8.2 μg/mL，2-MCPD:7.5 μg/mL，Gly:8.7 μg/mL）：準確移取750 μL混合標準儲備溶液至5mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混勻。

混合標準工作溶液II（3-MCPD:3.3 μg/mL，2-MCPD:3.0 μg/mL，Gly:3.5 μg/mL）：準確移取300 μL混合標準儲備溶液至5mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混勻。

混合標準工作溶液III（3-MCPD:0.16 μg/mL，2-MCPD:0.15 μg/mL，Gly:0.17 μg/mL）：準確移取100 μL混合標準工作溶液I至5mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混勻。

內(nèi)標儲備液（13C3-3-MCPD:46.9 μg/mL，D5-2-MCPD:50.2 μg/mL，D5-GLy:63.8 μg/mL）：分別準確稱取1.22 mg 13C3-3-MCPD-PP標準品、1.41 mg D5-2-MCPD-SS標準品、1.28 mg D5-Gly-P標準品于3個5 mL容量瓶中，用甲苯溶解并定容至刻度，混勻。

內(nèi)標混合標準工作溶液（13C3-3-MCPD:1.876 μg/mL，D5-2-MCPD:1.004 μg/mL，D5-Gly:1.276 μg/mL）：分別準確移取1.0 mL 13C3-3-MCPD-PP內(nèi)標儲備溶液、0.5 mL D5-2-MCPD-SS內(nèi)標儲備溶液和0.5 mL D5-GLy-P內(nèi)標儲備溶液至25 mL容量瓶中，用甲苯稀釋并定容至刻度。

標品配制注意事項

1.標準溶液濃度需根據(jù)標品實際稱樣質(zhì)量、標品純度以及目標物折算系數(shù)進行具體計算。

2.可選擇安譜璀世溶液型標品，進行稀釋配制，操作更加方便。

2、基質(zhì)標準曲線配制

稱取100 mg橄欖油基質(zhì)空白油，裝入10個獨立的樣品瓶。如下表所示，加入甲苯、tBME、內(nèi)標工作溶液和相應(yīng)的混合標準工作溶液，按照“樣品前處理”進行操作，上機檢測得到標準曲線。

表2 標準曲線的配制

三、前處理步驟

試劑配置：

硫酸水溶液（25%）：將25 mL硫酸轉(zhuǎn)移至含有50mL純水的100mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻。

酸性溴化鈉溶液（溴化鈉600 mg/mL，硫酸體積分數(shù)為0.9%）：將60 g溴化鈉溶解于70 mL純水中。將溴化鈉溶液轉(zhuǎn)移至含有3.6 mL 25%硫酸溶液的100mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻。

甲醇鈉溶液（0.35 mol/L）：將8 mL甲醇鈉溶液（質(zhì)量分數(shù)為25%）轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線并混勻。

苯基硼酸溶液：稱取12.0 g苯基硼酸，加入100 mL 的丙酮:水=(95:5)溶液，混勻。

試樣提?。?/b>

準確稱取0.10~0.12 g（精確至0.0001 g）食用油/油脂樣品于螺口玻璃試管 (貨號：VJEQ-38013CT-13100-100)中，加入100 μL甲苯、200 μL叔丁基甲醚，再加入100 μL內(nèi)標混合標準工作溶液。渦旋混勻10 s，10°C水浴冷卻至少4 min。

酯交換反應(yīng)：

加入100 μL 0.35 mol/L甲醇鈉溶液，蓋緊蓋子，渦旋混勻10 s，開始酯交換反應(yīng)。繼續(xù)10°C±1℃水浴10 min。然后加入300 μL酸性溴化鈉溶液，停止反應(yīng)。渦旋混勻10 s，讓溫度穩(wěn)定在室溫靜置至少5 min，以使所有縮水甘油完全轉(zhuǎn)化為 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）。

試樣凈化：

在樣品中加入300 μL異辛烷，渦旋混勻10 s，取出上層有機相，棄去。再加入600 μL異辛烷，渦旋10 s，然后取出上層有機相，棄去，注意不要取到任何水層。

衍生化反應(yīng)：

向凈化液中加入100 μL苯基硼酸溶液，渦旋20 s后，加入600 μL異辛烷，渦旋混勻10 s，移取上層含有衍生物的有機相，加入0.5g無水硫酸鈉，渦旋混勻10 s，提取液過0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測定。

前處理注意事項

1.若樣品常溫下為固體，稱樣后可在 80℃水浴，250 r/min震蕩攪拌2 min，直至所有脂肪融化溶解；

2.0.35 mol/L甲醇鈉溶液建議存放在4℃條件下，臨用前拿出；

3.10°C低溫酯交換反應(yīng)時需盡量將整個螺紋瓶浸泡在水中，以保證螺紋瓶內(nèi)溫度穩(wěn)定；

4.試樣凈化過程時，若出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，可在 80℃下水浴振蕩，至樣品溶液完全溶解，待樣品冷卻后取出上層有機相棄去；

5.前處理過程中盡量避免試樣塑料耗材，可使用玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動進樣針等耗材，建議進行方法空白實驗監(jiān)控過程本底情況；

6.建議使用疏水性PTFE針式濾器進行過濾；

7.前處理過程中會存在3-氯-1, 2-丙二醇酯轉(zhuǎn)換生成的縮水甘油（Gly）的副反應(yīng)，在上述條件下，13C3-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯（13C3-3-MCPD-PP）轉(zhuǎn)換為13C3-Gly的轉(zhuǎn)換率需控制在10%左右，如轉(zhuǎn)換率過高需排查前處理過程；

8.在上述條件下，2-MCPD可轉(zhuǎn)化為縮水甘油的比率<1%，可以忽略不計。

四、儀器條件

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀

色譜柱：毛細管氣相色譜柱CD-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

進樣量：2μL

進樣口溫度：300℃

進樣模式：不分流進樣

載氣：氦氣，純度≥99.999 %

色譜柱流速：1.0mL/min

程序升溫：70 ℃保持1 min，10 ℃/min升至100 ℃，5 ℃/min升至180 ℃，以25 ℃/min升至320 ℃保持5 min。

傳輸線溫度：320℃    離子源溫度：280℃

離子化能量：70eV     溶劑延遲時間：8min

掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM模式），離子對信息見下表：

表3 目標物離子對信息

儀器維護注意事項

1.隨著進樣次數(shù)的增加，儀器輕微污染，目標物保留時間可能發(fā)生偏移；

2.該實驗對儀器污染比較嚴重，儀器受到嚴重污染后，可能導(dǎo)致目標物響應(yīng)降低、分離度變差等情況，需注意儀器的清洗維護，包括進樣針的清洗，離子源的清洗，色譜柱的老化等；

3.如儀器配制程序升溫進樣口和反沖功能，可明顯降低對儀器的污染程度。

4.建議色譜柱加裝2m 相同固定相的預(yù)柱，定期對預(yù)柱進行更換，可延長色譜柱的使用壽命。

五、實驗譜圖

圖1 氯丙醇酯和縮水甘油酯標準溶液譜圖

（標線第5點  STD-5）

圖2 橄欖油樣品空白和樣品加標的TIC譜圖

（上圖為樣品空白，下圖為樣品加標1mg/kg）

圖3 大豆油樣品空白和樣品加標的TIC譜圖

（上圖為樣品空白，下圖為樣品加標1mg/kg）

圖4 菜籽油樣品空白和樣品加標的TIC譜圖

（上圖為樣品空白，下圖為樣品加標1mg/kg）

圖5 葵花籽油樣品空白和樣品加標的TIC譜圖

（上圖為樣品空白，下圖為樣品加標1mg/kg）

六、實驗數(shù)據(jù)

1、標準曲線數(shù)據(jù)

橄欖油基質(zhì)中3-MCPD、2-MCPD、Gly的標準曲線和相關(guān)系數(shù)見下表：

表4  3-MCPD、2-MCPD、Gly的標準曲線

注意事項

1.標準溶液濃度需根據(jù)標品實際稱樣質(zhì)量、標品純度以及目標物折算系數(shù)進行具體計算。

2.可選擇安譜璀世溶液型標品，進行稀釋配制，操作更加方便。

2、加標回收率數(shù)據(jù)

橄欖油、大豆油、菜籽油和葵花籽油樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量見下表。

表5  不同植物油基質(zhì)的3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量

注：1、N.D表示未檢出。

       2、表中縮水甘油酯含量的計算均校正了3-氯-1, 2-丙二醇酯的轉(zhuǎn)換影響。

橄欖油、大豆油、菜籽油和葵花籽油樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率數(shù)據(jù)見下表。

表6  不同植物油基質(zhì)的加標回收率數(shù)據(jù)（n=6）

注：表中縮水甘油酯含量的計算均校正了3-氯-1, 2-丙二醇酯的轉(zhuǎn)換影響。

數(shù)據(jù)計算注意事項

1.2-氯丙醇酯的內(nèi)標建議選擇D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯；

2.縮水甘油酯是通過前處理轉(zhuǎn)換為 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）進行上機檢測；

3.樣品中縮水甘油酯的計算需扣除3-氯-1, 2-丙二醇酯轉(zhuǎn)換生成的縮水甘油（Gly）的影響，而轉(zhuǎn)換量是通過同位素內(nèi)標13C3-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯（13C3-3-MCPD-PP）轉(zhuǎn)換為同位素標記的13C3-Gly進行計算得到。

4.根據(jù)標準要求，建議樣品中Z 終氯丙醇酯和縮水甘油酯的含量需校正加標回收率。

七、實驗結(jié)論

使用安譜實驗標準品和相關(guān)耗材，參照國際標準“ISO 18363-4:2021 Animal and vegetable fats and oils - Determination of fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS - Part 4: Method using fast alkaline transesterification and measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol by GC-MS/MS”和國標征求意見稿“GB 5009.191-×××× 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定 第二篇第 一法”，對快速堿水解條件進行優(yōu)化，使用同位素內(nèi)標法進行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在85%-115%之間，RSD均小于10%。該方法操作簡便，快速，穩(wěn)定，能夠很好的滿足植物油基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測。

八、實驗中所用到的耗材