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2025年2月由中國南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院整形美容外科的Jingyan Gua研究團(tuán)隊(duì)在《Journal of Tissue Engineering》期刊（IF: 6.8）發(fā)表了一篇“Dissolving microneedle patch loaded with adipokines-erriched adipose extract relieves atopic dermatitis in mouse via modulating immune disorderss, microbiota imbalance, and skin barrier defects”研究論文。研究針對特應(yīng)性皮炎（AD）這一慢性復(fù)發(fā)性皮膚病，此前團(tuán)隊(duì)已研發(fā)出一種物理提取的脂肪來源細(xì)胞外基質(zhì)——脂肪膠原片段（ACF），其含大量基質(zhì)結(jié)合脂肪因子，經(jīng)皮內(nèi)注射對AD有治療作用，但存在藥物釋放控制不佳和注射疼痛等問題。鑒于微針（MN）技術(shù)在精準(zhǔn)無痛經(jīng)皮給藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，本研究開發(fā)了負(fù)載ACF的甲基丙烯酰化明膠/透明質(zhì)酸可溶解微針貼片（ACF-MN），評估了其形態(tài)特征、機(jī)械性能、滲透能力、生物相容性和降解效率，并探究了其在卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的AD小鼠模型中的療效及作用機(jī)制。

摘要

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚病，亟需新的治療方法。該研究團(tuán)隊(duì)此前研發(fā)了一種物理提取的脂肪來源細(xì)胞外基質(zhì)，命名為脂肪膠原片段（ACF），經(jīng)證實(shí)其含有大量與脂肪基質(zhì)結(jié)合的脂肪因子，通過皮內(nèi)注射對AD具有治療效果。然而，藥物釋放控制難題及注射帶來的不可避免的疼痛，阻礙了ACF的應(yīng)用。微針（MN）是一種快速發(fā)展的無痛經(jīng)皮給藥技術(shù)。因此，本研究開發(fā)了一種負(fù)載ACF的甲基丙烯?；髂z/透明質(zhì)酸可溶解微針貼片。研究評估了ACF-MN的形態(tài)特征、機(jī)械性能、滲透能力、生物相容性和降解效率，并探究了其對卵清蛋白誘導(dǎo)的AD小鼠的療效。結(jié)果表明，ACF-MN具有優(yōu)異的滲透能力、生物相容性和降解效率，對小鼠AD的效果與新鮮制備的ACF相當(dāng)。此外，通過RNA測序結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)探究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，ACF治療可通過恢復(fù)炎癥失調(diào)、微生物群失衡和皮膚屏障缺陷，對AD發(fā)揮綜合治療效果。本研究提供了一種新型的基于微針的ACF結(jié)合脂肪因子經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，有望成為緩解AD的有效策略。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：6周齡雌性BALB/c小鼠。

2.生物材料：脂肪組織、甲基丙烯?；髂z、透明質(zhì)酸、光引發(fā)劑、聚乙烯醇、明膠、卵清蛋白、脂多糖、 Nile紅染料、磷酸鹽緩沖液、DISPASE?、各種神經(jīng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品。

3.試劑盒與試劑：ELISA試劑盒、TRIzol Reagent?、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA提取試劑盒、PicoGreen dsDNA檢測試劑盒。

4.抗體：抗絲聚蛋白兔多克隆抗體、抗兜甲蛋白兔多克隆抗體 、二抗。

5.染色劑：4%臺盼藍(lán)溶液、10%福爾馬林、蘇木精-伊紅（H&E）染色劑、甲苯胺藍(lán)（TB）染色劑。

實(shí)驗(yàn)儀器

1.樣品制備儀器：高速均質(zhì)機(jī)、聚二甲基硅氧烷模具、真空設(shè)備、紫外照射設(shè)備、干燥劑、位移力測試站。

2.表征與檢測儀器：光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡、ImageJ軟件（NIH）、體內(nèi)成像系統(tǒng)、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、Illumina Hiseq 3000測序平臺、Illumina NovaSeq6000測序平臺、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、PCR儀、石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)。

實(shí)驗(yàn)過程

ACF制備

從6周齡雌性BALB/c小鼠處獲取腹股溝脂肪，用PBS洗滌兩次以去除紅細(xì)胞，無菌剪刀剪碎后離心，棄去液體部分。使用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化脂肪組織，依次通過0.25mm和0.15mm不銹鋼濾網(wǎng)過濾，3000g離心3min后，分離出的膠原沉淀物即為ACF，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

ACF-MN貼片制備

采用12×12微針陣列的PDMS模具，其微針凹槽中心間距、基底直徑、高度和尖端直徑分別為1000μm、460μm、1000μm和15μm。將1g Gel-MA和0.1g HA混合并溶解于10ml 0.1%光引發(fā)劑中，按不同質(zhì)量比加入ACF，超聲振動分散，取200μl澆鑄液加入PDMS模具頂部，真空處理5min、紫外照射2min后，4℃干燥劑干燥5h。隨后，向模具中加入200μl含10% PVA（w/v）和20%明膠（w/v）的第二澆鑄液，真空處理5min，4℃干燥劑干燥24h。最后，在PDMS模具上放置粘性紙，小心脫模得到ACF-MN貼片，4℃干燥劑保存?zhèn)溆谩?/span>

ACF-MN貼片相關(guān)性能檢測

1.形態(tài)學(xué)表征：通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察ACF-MN的微觀特征，利用ImageJ軟件測量其中心間距、高度、基底直徑和尖端直徑（每組n=10）。

2.斷裂力測試：采用位移力測試站對不同ACF與Gel-MA/HA質(zhì)量比的ACF-MN進(jìn)行單軸壓縮試驗(yàn)，測定斷裂力。

3.體外皮膚插入實(shí)驗(yàn)：選取最優(yōu)ACF/Gel-MA/HA質(zhì)量比的ACF-MN貼片，垂直按壓到離體小鼠皮膚，分別放置5、10、30、60min后移除。用4%臺盼藍(lán)溶液染色10min，10%福爾馬林固定皮膚，石蠟包埋切片（4μm）并進(jìn)行H&E染色，光學(xué)顯微鏡觀察剩余ACF-MN貼片，計(jì)算插入率（插入率=插入的微針數(shù)量/貼片中總微針數(shù)量（144）×100%）。

體外抗炎和免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)

制備小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7），37℃培養(yǎng)至貼壁，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，加入LPS刺激炎癥因子產(chǎn)生，同時(shí)加入不同ACF與Gel-MA/HA質(zhì)量比的微針貼片，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，超聲破碎釋放內(nèi)容物，離心收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-6水平。

ACF-MN貼片體內(nèi)應(yīng)用相關(guān)實(shí)驗(yàn)

1.生物安全性評估：將ACF-MN貼片應(yīng)用于健康BALB/c小鼠背部皮膚，30min后移除，觀察7天內(nèi)皮膚反應(yīng)。

2.體內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)：向2:1的ACF/Gel-MA/HA溶液中加入5%尼羅紅染料（w/v），超聲振動混勻，制備熒光ACF-MN貼片，應(yīng)用于健康BALB/c小鼠背部皮膚30min，通過體內(nèi)成像系統(tǒng)在0、1、3、7、10天捕獲并測量應(yīng)用部位的熒光面積和強(qiáng)度。

AD小鼠模型制備與治療

將小鼠分為4組（每組n=6）：正常對照組（無AD誘導(dǎo)）、PBS組（AD誘導(dǎo)+PBS處理）、ACF組（AD誘導(dǎo)+新鮮制備的ACF處理）、ACF-MN組（AD誘導(dǎo)+ACF-MN貼片處理）。采用OVA重復(fù)表皮激發(fā)建立AD樣皮膚損傷模型：6周齡雌性BALB/c小鼠麻醉剃毛后，用3M膠帶剝離背部皮膚6次，再用浸有100μg/100μl OVA/生理鹽水溶液的無菌紗布致敏，每間隔2周致敏一次，共3輪。在致敏期的第28天和第35天，ACF組和PBS組分別向小鼠背部致敏部位皮內(nèi)注射0.1ml ACF或PBS，ACF-MN組在相同部位應(yīng)用ACF-MN貼片30min后移除。第50天，使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀測量小鼠背部皮膚經(jīng)表皮水分（TEWL）水平，棉簽收集皮膚微生物樣本，隨后處死小鼠，收集背部皮膚，一半于-80℃保存，另一半用10%福爾馬林固定備用。

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

ACF 對卵清蛋白誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚屏障修復(fù)能力的評價(jià)。

(a)ACF 組與 PBS 組中不飽和脂肪酸生物合成及脂肪酸延長通路的基因集富集分析（GESA）和樣本聚類分析。

(b) 采用液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）檢測正常對照組（NC）、PBS 組及 ACF 組小鼠皮膚中非硫酸化神經(jīng)酰胺（NS - 神經(jīng)酰胺）的組成。

(c) 三組小鼠絲聚蛋白的代表性免疫組化（IHC）染色圖像。

(d) 三組小鼠兜甲蛋白的代表性免疫組化（IHC）染色圖像。比例尺：上欄 50 微米；下欄 20 微米。

(e) 采用 Image J 軟件檢測的絲聚蛋白表達(dá)水平（n=10，均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差）。

(f) 采用 Image J 軟件檢測的兜甲蛋白表達(dá)水平（n=10，均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差）。

(g) 三組小鼠背部皮膚的經(jīng)皮水分流失值（TEWL）

AD癥狀評估與相關(guān)檢測

1.AD癥狀嚴(yán)重程度評估：由兩名獨(dú)立研究者對紅斑/出血、結(jié)痂/抓痕、滲液/糜爛、腫脹/水腫、干燥、苔蘚化6項(xiàng)癥狀進(jìn)行評分（0=無，3=嚴(yán)重），計(jì)算總分平均值。

2.組織學(xué)檢查：將固定的皮膚樣本石蠟包埋切片（4μm），進(jìn)行H&E和TB染色，顯微鏡下觀察，ImageJ軟件測量表皮厚度（H&E染色切片）和計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞浸潤數(shù)量（TB染色切片，每組10個(gè)位點(diǎn)）。

3.RNA-Seq分析：提取NC組、PBS組、ACF組皮膚樣本總RNA，純化后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，連接接頭后PCR擴(kuò)增構(gòu)建文庫，Illumina Hiseq 3000平臺測序（150bp雙端 reads），經(jīng)數(shù)據(jù)處理后進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEGs）篩選和KEGG富集分析、GSEA分析。

4.qPCR檢測：提取皮膚樣本RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用FastStart Universal SYBR Green Master Mix進(jìn)行qPCR，以β-肌動蛋白為內(nèi)參基因，檢測IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-13、IL-17的相對基因表達(dá)水平。

5.16S靶向擴(kuò)增子測序：提取皮膚微生物樣本總細(xì)菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因V4區(qū)（引物515F和806R），純化定量后混合，Illumina NovaSeq6000平臺測序，進(jìn)行OTU聚類和分類學(xué)分析，比較各組微生物豐富度和屬水平物種豐度。

6.LC-MS分析：皮膚樣本經(jīng)DISPASE?酶解分離表皮，提取脂質(zhì)，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析CER(NS)物種的相對含量。

7.免疫組織化學(xué)（IHC）：皮膚組織切片經(jīng)封閉后，加入一抗（抗filaggrin、抗loricrin）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5h，顯微鏡下觀察。

統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），隨后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，p≤0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究成功開發(fā)了負(fù)載ACF的甲基丙烯?；髂z/透明質(zhì)酸可溶解微針貼片（ACF-MN），其中ACF與Gel-MA/HA質(zhì)量比為2:1的ACF-MN具有均勻的形態(tài)和足夠的物理強(qiáng)度，能夠穩(wěn)定插入皮膚且副作用極小。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，ACF-MN貼片與ACF注射類似，可有效緩解AD樣皮膚損傷的炎癥反應(yīng)，改善AD臨床癥狀和病理變化，包括減輕表皮增厚、減少肥大細(xì)胞浸潤等。通過RNA測序結(jié)合相關(guān)檢測技術(shù)初步闡明，ACF對AD具有綜合效果，其機(jī)制涉及調(diào)節(jié)免疫紊亂（下調(diào)炎癥相關(guān)通路及細(xì)胞因子表達(dá)）、改善微生物群失衡（增加皮膚微生物多樣性、抑制葡萄球菌增殖）以及糾正脂質(zhì)合成失調(diào)（上調(diào)脂肪酸合成和延長相關(guān)通路，恢復(fù)神經(jīng)酰胺組成，促進(jìn)皮膚屏障修復(fù)）。該ACF-MN貼片有望替代傳統(tǒng)ACF注射，成為緩解AD的有前景的給藥策略。但本研究的RNA-Seq分析僅為ACF提供了初步見解，未來需進(jìn)一步探索ACF影響AD的具體通路和基因，優(yōu)化MN貼片中ACF的劑量。此外，ACF及ACF-MN貼片也可能用于緩解其他具有類似發(fā)病機(jī)制的炎癥性皮膚病（如銀屑病、濕疹），尤其是慢性期患者。

參考文獻(xiàn)

1.Tha?i D, Simpson EL, Beck LA, et al. Efficacy and safety of dupilumab in adults with moderate-to-severe atopic dermatitis inadequately controlled by topical treatments: a randomised, placebo-controlled, dose-ranging phase 2b trial. Lancet 2016; 387: 40–52. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(15)01079-7

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