MHC-I類分子在細胞表面呈遞源自細胞內(nèi)抗原的肽段，用于免疫監(jiān)視，而針對這些肽-MHC（pMHC）復(fù)合物的特異性靶向在疾病治療中具有重要應(yīng)用價值。然而，這種靶向非常具有挑戰(zhàn)性，因為它需要識別肽抗原中少量向外暴露的殘基，同時避免與幾乎所有細胞上都存在的MHC載體發(fā)生廣泛接觸。

諾獎得主David Baker團隊在Science上發(fā)表文章，使用 深度學(xué)習(xí)驅(qū)動的蛋白質(zhì)設(shè)計工具（RFdiffusion + ProteinMPNN），從頭設(shè)計（de novo）小型蛋白（<150 aa），使其跨越MHC肽結(jié)合槽并與肽段形成廣泛接觸。通過AlphaFold2/3和Chai-1預(yù)測驗證結(jié)構(gòu)，結(jié)合部分擴散（partial diffusion）策略快速適配不同pMHC目標。

針對10個不同的pMHC復(fù)合物（涵蓋病毒抗原、腫瘤相關(guān)抗原、neoantigen），設(shè)計并篩選出高特異性結(jié)合蛋白。全基因合成后克隆到pET29b(+) 載體中，大腸桿菌表達后，使用Ni柱和凝膠過濾（Superdex 75 10/300GL）兩步純化。

結(jié)合動力學(xué)分析在Biacore8K通過Biotin CAPture Kit捕獲法完成。捕獲生物素化的肽-MHC單體約250 RU，蛋白binder（分析物）在HBS-EP+緩沖液中，以30 μL/min 流速進樣，濃度范圍為1 nM 至1 μM。

結(jié)果顯示，設(shè)計的蛋白與目標 pMHC 的結(jié)合親和力在 幾到幾十納摩爾（nM）范圍（圖1，圖2），顯示出高親和力。

圖1：針對HIV (b)和 MAGE-A3 (c)設(shè)計的蛋白binder的凝膠過濾圖譜，SPR結(jié)合傳感圖，結(jié)構(gòu)模型

圖2：針對PRAME binder A9/A2結(jié)合

PRAME pMHC單體的SPR結(jié)合傳感圖

設(shè)計的免疫原支架全基因合成后克隆到pET11b載體中，E.?coli BL21 (DE3)表達后，使用Ni柱和凝膠過濾（HiLoad 16/600 Superdex 75 column）兩步純化。

RSVF蛋白ExpiCHO細胞表達，使用Ni柱，StrepTrap HP affinity column和凝膠過濾（Superdex200 Increase 10/300 GL column）三步純化。

抗體IgG和Fab蛋白HEK-293T細胞表達，使用5 ml HiTrap Protein A HP 柱純化IgG，使用5 ml kappa-select 柱純化 Fab，通過Superdex200 Increase 10/300 GL柱進行 凝膠過濾進一步純化。

SPR測定在Biacore 8K儀器上使用CM5芯片完成。固定設(shè)計的免疫原支架以及 RSVF 三聚體，流過Fab抗體（圖3）?；蛘吖潭ǜ鞣NIgG ，流過設(shè)計的單體蛋白（圖4）。分析物3倍或6倍梯度稀釋進樣，結(jié)合120s，解離600s，使用0.1?M Glycine (pH 3.0)再生。

結(jié)果顯示，單表位設(shè)計（RSVFV-1 至 RSVFV-4）：KD 范圍：54–241 nM（比天然 RSVF 三聚體的0.9 nM 差約50倍，但比之前報道的設(shè)計0.9? μM提高約20倍）。

圖3：針對 RSV90 Fab 的四種設(shè)計的SPR穩(wěn)態(tài)親和力測定

圖4：針對三種特異性表位抗體RSV90(site V), motavizumab(site II), 101F(site IV)的各四種設(shè)計的 SPR 穩(wěn)態(tài)親和力測定

SPR 數(shù)據(jù)驗證了設(shè)計蛋白能與目標抗體結(jié)合，且多表位設(shè)計在結(jié)構(gòu)復(fù)雜度增加的情況下仍保持納摩爾級結(jié)合能力，證明深度學(xué)習(xí)方法在多表位免疫原設(shè)計中的可行性。

研究使用計算機輔助設(shè)計結(jié)合實驗驗證：通過ELISA、Western blot、免疫組化、SPR等方法驗證表位與抗體結(jié)合能力及免疫效果。SPR測定在 Biacore T200儀器上使用CM5芯片完成。將 S390F肽通過氨基偶聯(lián)固定在FC2上，F(xiàn)C1作為參比。運行緩沖液為1×PBS（pH 7.4）+5% DMSO。通過不同濃度的DMSO（4.5%–5.8%）自動生成溶劑校正曲線。將稀釋后的抗體scFv1進樣，使用10 mM Gly-HCl（pH 2.0）再生。

圖5：利用SPR技術(shù)分析表位肽S390F與純化抗體scFv1之間的結(jié)合能力

S390F與scFv1的KD值為573 nM，顯示強結(jié)合能力，優(yōu)于其他突變肽（如T395F、S404Y）和原始P30肽。SPR驗證了計算機模擬的可行性，證明抗體結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的表位優(yōu)化策略有效。該結(jié)果與ELISA、免疫學(xué)實驗一致，進一步確認 S390F是免疫增強型表位疫苗的最佳候選。

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