ELISA是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的定性定量檢測(cè)方法，可檢測(cè)樣本范圍十分廣泛，比如血液（血清、血漿）、組織勻漿或提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液、分泌物（唾液、乳汁）、排泄物（尿液、大便）等，甚至還可以檢測(cè)土壤中的蛋白樣品。

不同類型樣本的處理方法也大相徑庭。有些樣本可直接進(jìn)行測(cè)定，有些則需預(yù)處理。如何正確處理這些樣本，是確保ELISA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的第一步，也是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到并需要認(rèn)真對(duì)待的問(wèn)題。

「ELISA問(wèn)診室」第7期，匯總不同類型樣本的處理方法，供大家參考。

一、血液樣本

1. 血清

血清是ELISA實(shí)驗(yàn)常用的樣本之一，其預(yù)處理過(guò)程也比較簡(jiǎn)單。基本操作步驟如下：

① 用真空采血針采集新鮮血液2mL，加入無(wú)菌試管或離心管中。

② 將試管或離心管在室溫放置1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。血液自然凝固過(guò)程與溫度有關(guān)，溫度越低凝聚越緩慢。

③ 4℃，3000rpm離心10-20分鐘。

④ 取上清，棄沉淀。

⑤ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

⑥ 剩余上清可分裝凍存于-20℃或-80℃。分裝是為了避免反復(fù)凍融。如出現(xiàn)沉淀需再次離心。

2. 血漿

血漿需要抗凝，常用的抗凝劑有EDTA鈉鹽、肝素鈉、枸櫞酸鈉或檸檬酸鈉。檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說(shuō)明書，查看該試劑盒針對(duì)抗凝劑是否有特殊要求。

血漿的處理步驟主要為：

① 將全血收集到無(wú)菌的含抗凝劑的試管中，輕輕混勻。

② 4℃，3000rpm離心10-20分鐘。

③取上清，棄沉淀。

④立即取適量血漿進(jìn)行檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃。

二、組織樣本

動(dòng)物或人體組織進(jìn)行ELISA檢測(cè)，需要制成組織勻漿。

(1) 用預(yù)冷的PBS緩沖液（0.01M，pH=7.4）或生理鹽水洗滌組織。

(2) 稱重，再將其切成盡可能小的碎塊。加入適量預(yù)冷的PBS，一般按1:9的重量體積比添加，比如1g的組織樣品需加入9mL PBS。建議在PBS中加入蛋白酶抑制劑（如1mM PMSF）。

(3) 通過(guò)手工研磨或勻漿機(jī)處理樣本，也可選擇超聲粉碎。

(4) 將制備好的勻漿在4℃ 5000g離心5分鐘，留取上清用于檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃。

三、細(xì)胞樣本

細(xì)胞培養(yǎng)上清

采集細(xì)胞培養(yǎng)上清500 μL到無(wú)菌試管中，4℃，2500 rpm離心5-10分鐘，將澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液移至新的離心管中，棄沉淀。

取適量上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。剩余上清液需立即分裝，并保存在-80℃，避免反復(fù)凍融。

細(xì)胞裂解液

如果ELISA檢測(cè)的蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，則需要先收集細(xì)胞，洗滌干凈后再破損裂解，離心取上清。

對(duì)于懸浮細(xì)胞：4℃，2500 rpm離心5-10分鐘，棄上清，沉淀為細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞中雜質(zhì)，在沉淀中加入0.1-1mL PBS，用移液槍輕輕吹打混勻。4℃，2500 rpm離心5-10分鐘，收集細(xì)胞。

對(duì)于貼壁細(xì)胞：吸走培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗3次。然后用胰蛋白酶消化。4℃，2500 rpm離心5-10分鐘，棄上清，沉淀為細(xì)胞。

細(xì)胞裂解操作：

加入中強(qiáng)度RIPA細(xì)胞裂解液（pH7.3），含有蛋白酶抑制劑，一般106個(gè)細(xì)胞加入150-250μL裂解液。裂解液不建議使用含NP-40、Triton X-100和高濃度DTT的組分。如果沒有RIPA裂解液，可使用50mM Tris+0.9% NaCL+0.1% SDS,PH 7.3及適量蛋白酶抑制劑（如PMSF，工作濃度1 mmol/L）。也可選擇冰上超聲處理樣品，功率150-300W，裂解1-2s，間歇20-30s，3-5個(gè)循環(huán)。

裂解或超聲破碎完成后，4℃，10000rpm離心10min，上清移入新的EP管中，立即用于檢測(cè)，或分裝于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

四、特殊樣本的處理

1. 唾液

用無(wú)菌管收集未刺激的唾液2-5mL，4℃以4000 rpm的速度離心15分鐘，除去任何顆?；虺练e物。取上清進(jìn)行檢測(cè)。其余上清可分裝后保存于-80℃。

2. 痰液

選擇痰液中較為粘稠部分稱重，加2倍體積的0.1% DTT（二硫蘇糖醇）溶解粘液，反復(fù)吹打，渦旋震蕩15-30s。在加2倍于痰量的PBS緩沖液，振蕩混勻15-20分鐘。4℃，1500 rpm離心10分鐘，吸取上清進(jìn)行檢測(cè)或保存。

3. 尿液

用無(wú)菌容器收集當(dāng)天初次中段尿液。4℃，2000-3000 rpm離心20分鐘，收集上清進(jìn)行檢測(cè)或-80℃保存。

4. 腦脊液

臨床上人腦脊液的抽取采用腰椎穿刺法。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠的腦脊液量較少，可以針頭插入枕骨打孔抽取，當(dāng)出現(xiàn)紅色液體時(shí)說(shuō)明腦脊液已經(jīng)抽完。樣品收集后，4℃，2000-3000 rpm離心20分鐘，收集上清進(jìn)行檢測(cè)或-80℃保存。

胸腹水、關(guān)節(jié)積液可參考才方法。

5. 肺泡灌洗液

在纖維支氣管鏡下，按照常規(guī)方法進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。每次注入無(wú)菌生理鹽水20 mL，然后緩慢洗出?；厥辗闻莨嘞匆海?℃，2000-3000 rpm離心10分鐘，收集上清進(jìn)行檢測(cè)或-80℃保存。

6. 乳汁

收集樣品，4℃，2000-3000 rpm離心15分鐘，收取上清。重復(fù)離心3次，取上清進(jìn)行檢測(cè)或-80℃保存。

7. 糞便

將糞便用PBS洗3次，一般情況下每克糞便中加入9mL PBS緩沖液。超聲破碎，功率150-300W，裂解1-2s，間歇20-30s，3-5個(gè)循環(huán)。然后5000×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃?zhèn)溆谩?/p>

8. 精液

收集精液后需在室溫或37℃條件下，用纖維蛋白溶解酶進(jìn)行處理。之后將精液于4℃，4000 rpm離心10 分鐘分離精漿，進(jìn)行檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃?zhèn)溆谩?/p>

9. 蛋黃

取新鮮蛋黃用超純水稀釋10倍。用鹽酸調(diào)pH至5.0-5.2，4℃靜置6小時(shí)，然后10000 rpm離心10分鐘，收集上清。再調(diào)pH至7.2-7.4，進(jìn)行檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃?zhèn)溆谩?/p>

10. 土壤

取1g土壤，加入9mL的PBS（pH7.3），充分混勻。4℃，5000-36000 rpm離心5分鐘，收取上清。

11. 植物樣本

取新鮮植物組織在液氮中研磨。加入樣品體積9倍的PBS緩沖液（pH7.3），于4℃，8000rpm，離心30分鐘，取上清進(jìn)行檢測(cè)。

留個(gè)作業(yè)：

我們雖然羅列的多種樣本的處理方法，但無(wú)法涵蓋各種樣本。對(duì)于一些特殊樣本，還需要參考已發(fā)表的文獻(xiàn)或Protocol，設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合理高效的樣本處理方案。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，大膽的在評(píng)論區(qū)說(shuō)出你的計(jì)劃吧?。ㄕf(shuō)不定會(huì)有人抄作業(yè)呢。）

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