洗板（Wash Plate）是ELISA實驗中操作次數(shù)最多的步驟，貫穿整個實驗過程。洗板的目的是去除未結合的游離物質，比如殘留在板孔中未能與固相抗原或抗體結合雜質、酶標記物等，以及實驗過程中非特異性吸附與固相載體的干擾物質，同時保留板上特異性結合的復合物。

「ELISA問診室」將為大家介紹ELISA實驗中操作次數(shù)最多的步驟——洗版的注意事項。

一、洗滌液組分與配制

洗滌液組成比較簡單，一般由pH 7.4的PBS或TBS，加入0.05%-0.5%的Tween-20或Triton X-100組成。實驗室常用PBS磷酸鹽緩沖體系，但如果使用堿性磷酸酶系統(tǒng)（如AP）則需改為TBS緩沖液。去污劑常選用Tween-20，其濃度在不同的實驗室會存在差異，但不能高于0.2%，否則會使特異性結合物解離，進而降低實驗靈敏度。

商業(yè)化的ELISA試劑盒一般提供濃縮液，比如20X，可按照1:19的比例進行稀釋，即取1mL濃縮液加入19mL去離子水稀釋混勻，具體稀釋量請根據(jù)實驗用量配制，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。本次實驗未使用完的1X洗滌液可以棄去。稀釋前應先觀察恢復至室溫的濃縮液是否有結晶，如有還請混勻或在37℃水浴鍋中使其溶解。

二、傳統(tǒng)古法：純手工洗板

雖然現(xiàn)在已經(jīng)有樣式多樣的自動或智能洗板機，但是作為傳統(tǒng)ELISA實驗人，還是推崇手工洗板，可能是因為手工細胞靈活性更高吧。

手工洗板主要有以下步驟：

1）準備工作

用去離子水或蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋到1X，將多層吸水紙鋪好，準備洗板操作區(qū)域。如果是使用商業(yè)化試劑盒，還請使用配套的洗滌液，請勿使用其他的，防止影響實驗結果。

2）加液

使用多道移液器或排槍，每孔中加入300-350μL 1X 洗滌液。加液時要保持槍口懸空，避免劃傷孔底或產(chǎn)生氣泡。洗滌液不要飛濺或溢出，防止污染。

3）浸泡

按照預實驗或試劑盒說明書要求，靜置30秒至1分鐘，讓洗滌液與孔內壁充分接觸，洗去未結合物。

4）倒液

體現(xiàn)技術活的時刻來了，操作要迅速、干脆，手腕不要左右搖擺，不能旋轉倒液。用拇指按住ELISA板一側的中間位置，用食指按照另一側，從底部托起ELISA板。然后迅速翻轉孔板，借助手臂的力量快速向下移動并突然停止。連貫的動作使液體借助慣性從孔板內甩出。手指、孔板條和板托外側都不應沾上液體，重復這個傾倒動作一次。

5）拍板

均勻且有力的拍板3次，每次拍板可使孔板水平旋轉180度，確?？變葻o可見液體。每次均將孔板倒扣在鋪有多層吸水紙的桌面上，每次拍板均要落在吸水紙未使用的區(qū)域。用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因為細小的粉塵或碎屑會吸附到孔底，導致洗板不干凈，結果偏高或偏低，復孔差值也較大。拍板需要巧勁并不是力量越大越好，力度太大可能會使抗體抗原結合物解離。

6）完成一輪洗板操作后重復以上第2-5步。一般洗板次數(shù)為3-5次。最后一次拍板后用干凈的濾紙擦拭孔板外部，清除殘留的洗滌液。不要讓孔板晾干，應盡快加入底物，防止酶活性受到影響。

三、洗板機操作自動化

與手工洗板相比，洗板機在效率、穩(wěn)定性、適應性等方面優(yōu)勢較大。

首先將ELISA板置于洗板機上，并設置洗板程序：如加液量（每孔250-350μL）、浸泡時間（5-10分鐘）、清洗次數(shù)（3-5次）。

然后啟動程序，洗板機會自動完成加液、浸泡、倒液的全過程。

最后結束程序，取出ELISA板，并在干凈的吸水紙上用力拍干。

總之，ELISA洗板機通過自動化和標準化的洗滌過程，有效提高實驗的可靠性和效率，提升ELISA實驗的成功率和準確性。

四、ELISA洗板常見問題解決方案

Q1：ELISA在哪些操作步驟之后需要洗板呢？

在ELISA實驗中，除了最后的顯色階段外，其他操作幾乎都需要洗板。比如：

1）包被之后：在抗原或抗體固定在孔板上，并完成孵育后需要進行洗板。目的是除去未與板孔結合的蛋白，防止這些游離的蛋白干擾后續(xù)實驗結果。

2）封閉之后：用BSA、脫脂奶粉等封閉液完成封閉后，需要去除多余的封閉液。如果有封閉液殘留會競爭結合檢測抗體或樣本中的蛋白，導致假陰性或信號偏低。

3）酶標板準備：商品化的預包被的酶標板在加入樣品或標準品之前，需要進行洗板，確保板孔無雜質并增強結合活性。

4）一抗孵育之后：待測樣本、標準品、特異性一抗完成孵育后，需要洗板除去未結合的蛋白、雜質等，這是降低背景噪聲關鍵的一步。

5）二抗孵育之后：酶標二抗完成孵育后，進行洗板操作。目的是除去未與一抗結合的酶標二抗，降低背景信號。

總之，洗板作為ELISA實驗中的關鍵步驟，幾乎貫穿整個操作過程，僅加入底物后顯示到加終止液兩步不需要洗板。

Q2：洗板次數(shù)不足會怎樣？

如果沒有完全除去未結合的蛋白或抗體，將會造成背景信號高、非特異性結合，導致整板全藍，出現(xiàn)假陽性。

Q3：過度洗板又會怎樣呢？

過度洗板會洗掉已經(jīng)結合的抗原抗體復合物，導致整體顯色變弱、甚至“白板”。

Q4：哪些操作會造成孔間交叉污染？

1）在用多通道移液器或排槍添加洗劑液時，槍頭伸到液面以下甚至戳到孔底。

2）洗滌液添加時飛濺或溢出到其他孔導致的污染。

3）在吸水紙的同一位置反復拍板。

Q5：不同試劑盒的洗滌液或者自己配的洗滌液可以混用嗎？

不可以。洗滌液的主要成分雖然大差不離，但是在具體濃度上可能會存在差異?；煊每赡軙c實驗體系不適配，實驗結果難預料。如果本試劑盒的洗滌液實在不夠用，建議咨詢產(chǎn)品的技術支持或查看說明書，充分了解洗滌液的組分及配比后再進行替換。

Q6：洗滌液濃縮液出現(xiàn)顆粒物或沉淀，是變質了嗎？

不一定。濃縮液鹽離子濃度相對較高，長期靜置或4℃保存，可能會有結晶析出。建議在使用前輕輕搖晃或37℃水浴至完全溶解。

實驗室達人們，你們更信賴手工洗板還是洗板機呢？歡迎大家在評論區(qū)說出你的答案！

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