近日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王國(guó)棟團(tuán)隊(duì)在《PNAS》發(fā)表題為 “A Balance between Glycitein and Glyceollins Governed by Isoflavone 6-Hydroxylase Confers Soybean Resistance to Phytophthora sojae” 的突破性文章，首次揭示了大豆異黃酮 6-羥化酶基因 GmIF6H1 通過(guò)調(diào)控黃豆黃素（glycitein）與大豆抗毒素（glyceollins）的代謝平衡，賦予大豆抗疫霉病能力的分子機(jī)制，為作物抗病育種開(kāi)辟了新路徑。

研究背景：爭(zhēng)議已久的合成路徑與亟待破解的抗病謎題

大豆疫霉病是全 球大豆產(chǎn)業(yè)的 “心腹之患”，每年造成巨額產(chǎn)量損失。大豆中的異黃酮類(lèi)物質(zhì)，既是對(duì)人體有益的天然營(yíng)養(yǎng)成分，也是植物抵御病原菌侵襲的 “核心防線”。異黃酮廣泛存在于豆科植物中，大豆作為其富集來(lái)源，含大豆苷元、染料木素、黃豆黃素三大類(lèi)異黃酮及其糖苷化、丙二酰化衍生物。其中黃豆黃素的生物合成路徑長(zhǎng)期存在爭(zhēng)議——傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其源于甘草素（Liquiritigenin）的 6 -羥基化途徑，卻缺乏充足的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

研究結(jié)果：四大突破解鎖大豆抗病新機(jī)制

1. 基因定位：mGWAS 鎖定黃豆黃素合成關(guān)鍵基因

研究團(tuán)隊(duì)對(duì) 727 份大豆自然群進(jìn)行代謝組全基因組關(guān)聯(lián)分析（mGWAS），成功將黃豆黃素及其衍生物的調(diào)控位點(diǎn)精準(zhǔn)定位到 11 號(hào)染色體的 200 kb 區(qū)域，最終篩選出關(guān)鍵基因 GmIF6H1（isoflavone 6-hydroxylase 1）。大豆毛狀根實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，過(guò)表達(dá) GmIF6H1 可顯著提高黃豆黃素及其衍生物含量。進(jìn)一步的體外酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GmIF6H1 具備嚴(yán)格的底物特異性，可精準(zhǔn)催化異黃酮苷，發(fā)生 6-羥基化反，進(jìn)而明確了 GmIF6H1 的核心生化功能為異黃酮 6-羥化酶。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析與體外酶活驗(yàn)證結(jié)果，證實(shí) 6-羥基化功能在豆科植物中具有進(jìn)化保守性。

圖 1. LC-QTOF 分析大豆自然群體的異黃酮含量

2. 單氨基酸變異：揭秘大豆馴化中的代謝取舍

深入分析發(fā)現(xiàn)，GmIF6H1 基因存在一個(gè)關(guān)鍵單核苷酸多態(tài)性（SNP），導(dǎo)致其編碼蛋白第 248 位氨基酸由蘇氨酸（Thr）替換為丙氨酸（Ala）。這一微小變異帶來(lái)顯著功能差異：攜帶 Thr248 的大豆材料（Hap2 單倍型）黃豆黃素含量顯著高于 Ala248 型（Hap1 單倍型），酶動(dòng)力學(xué)分析顯示 Thr248 變異體的催化效率是 Ala248 型的 5 倍。

單倍型頻率分析更揭示了人工選擇的痕跡：野生大豆中高活性單倍型（Thr248）占比 83.33%，而在地方品種和栽培品種中均降至約 52%，這也解釋了大豆馴化過(guò)程中黃豆黃素含量降低的分子機(jī)制。

3. 路徑顛覆：大豆苷元才是黃豆黃素的核心前體

團(tuán)隊(duì)通過(guò) CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建了三個(gè) GmIF6H1 缺失突變體，結(jié)果顯示突變體中黃豆黃素幾乎完全缺失，而其前體大豆苷元的含量顯著上升。穩(wěn)定同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（大豆苷元-d6 喂養(yǎng)）進(jìn)一步證實(shí)，野生型大豆中可檢測(cè)到黃豆黃素-d5 及其衍生物，突變體中無(wú)相關(guān)標(biāo)記產(chǎn)物，而過(guò)表達(dá)株系中標(biāo)記產(chǎn)物及中間產(chǎn)物均大量積累。綜合以上研究結(jié)果可知，GmIF6H 能夠特異性催化大豆苷元的 6-羥基化反應(yīng)，進(jìn)而形成黃豆黃素。

圖 2. 穩(wěn)定同位素分析標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

4. 代謝平衡：抗病性的 “關(guān)鍵密碼”，過(guò)猶不及

令人意外的發(fā)現(xiàn)來(lái)自大豆疫霉菌接種實(shí)驗(yàn)：不僅 GmIF6H1 缺失突變體對(duì)疫霉病敏感性顯著增加，過(guò)表達(dá)株系同樣表現(xiàn)出抗性下降。分析表明這種 “雙向敏感” 源于代謝平衡的破壞：

突變體中，黃豆黃素幾乎完全缺失，作為 “預(yù)存植保素” 的第一道防御防線失效，導(dǎo)致感病性增強(qiáng)；外施 200 μM 黃豆黃素可恢復(fù)突變體的抗病性，直接證實(shí)其抗病功能；

過(guò)表達(dá)株系中，黃豆黃素含量顯著升高，但作為 “誘導(dǎo)型植保素” 的大豆抗毒素 I 含量降低 1.6 倍。

研究提出大豆的雙重防御策略：黃豆黃素作為預(yù)存植保素，在感染初期發(fā)揮即時(shí)防御作用；大豆抗毒素作為誘導(dǎo)型植保素，通過(guò)感染后基因轉(zhuǎn)錄激活和從頭合成發(fā)揮持續(xù)防御作用。兩者共享前體大豆苷元，GmIF6H1 的精準(zhǔn)表達(dá)是維持這一平衡的核心——表達(dá)不足或過(guò)量都會(huì)導(dǎo)致防御失衡，增強(qiáng)感病性。

圖 3. W82 與 GmIF6H1 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大豆疫霉菌的易感性（LC-QQQ 實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵代謝物定量）

研究結(jié)論

該研究的科學(xué)價(jià)值體現(xiàn)在多個(gè)維度：一是顛覆了黃豆黃素的傳統(tǒng)合成路徑認(rèn)知，明確了大豆苷元為核心前體的主導(dǎo)路徑；二是揭示了 “預(yù)存植保素 - 誘導(dǎo)型植保素” 協(xié)同防御的新機(jī)制，強(qiáng)調(diào)了代謝平衡對(duì)植物抗病性的重要性；三是鑒定了 GmIF6H1 這一關(guān)鍵基因及功能變異位點(diǎn)，為大豆抗病分子育種提供了直接靶點(diǎn)；四是建立的代謝組學(xué)與基因組學(xué)結(jié)合的分析方法，為其他作物的代謝調(diào)控研究提供了重要參考。

在這項(xiàng)復(fù)雜的代謝機(jī)制研究中，安捷倫 LC-QTOF 和 LC-QQQ 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)憑借卓越性能，全程為研究提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。其中，LC-QTOF 對(duì)大豆種子及不同組織中的異黃酮進(jìn)行全面篩查與結(jié)構(gòu)確證，為 mGWAS 基因定位提供了精準(zhǔn)的表型數(shù)據(jù)；在酵母體外酶活實(shí)驗(yàn)中精準(zhǔn)檢測(cè)到 GmIF6H1 催化大豆苷元生成的產(chǎn)物，為路徑驗(yàn)證提供了直接證據(jù)。而 LC-QQQ 承擔(dān)了代謝物準(zhǔn)確定量的核心任務(wù)，如在穩(wěn)定同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中定量大豆苷元在不同基因型大豆中的代謝產(chǎn)物；在大豆疫霉感染實(shí)驗(yàn)中量化了黃豆黃素與大豆抗毒素 I 的含量動(dòng)態(tài)變化，清晰揭示了兩者的代謝流競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

研究團(tuán)隊(duì)介紹

中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所博士生楊麒麟為論文第一作者，王國(guó)棟研究員為通訊作者。博士生王伊寧，徐鑫丹，中國(guó)科學(xué)院昆明植物所苑佳，遺傳發(fā)育所代謝平臺(tái)張鳳霞，雀巢研發(fā)中心覃浩，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所李世豪，上海辰山植物園李建戌副研究員，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所林浩研究員，中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所李磊研究員，崖州灣國(guó)家實(shí)驗(yàn)室田志喜研究員參與了本研究。本研究得到生物育種國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性前沿重點(diǎn)研究計(jì)劃以及國(guó)家自然科學(xué)基金的資助。

參考文獻(xiàn)

[1] Q. Yang, Y. Wang, X. Xu, J. Yuan, F. Zhang, H. Qin, S. Li, J. Li, H. Lin, L. Li, Z. Tian, & G. Wang, A balance between glycitein and glyceollins governed by isoflavone 6-hydroxylase confers soybean resistance to Phytophthora sojae, Proc. Natl. Ac

標(biāo)簽：安捷倫