前言

黃曲霉毒素（Afatoxin，AF）作為黃曲霉和寄生曲霉的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，Z 早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代?，F(xiàn)階段已知其衍生產(chǎn)物約20余種（B1、B2、G1、G2、M1、M2等），廣泛存在于藥材中。

值得關(guān)注的是，黃曲霉毒素一直被世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)（其中B1毒性Z 強(qiáng)），所以國(guó)際上對(duì)于霉菌毒素含量都有非常嚴(yán)格的限量要求。

目前，對(duì)于藥材中B族和G族黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，主要參考如下標(biāo)準(zhǔn)：

《中國(guó)藥典》2020版，2351通則（具體項(xiàng)目見(jiàn)表1）

對(duì)于常規(guī)反相液相色譜，由于所用的溶劑（水、甲醇、乙腈）會(huì)使黃曲霉毒素B1和G1發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，很難直接測(cè)定。所以為了克服這一現(xiàn)象，通常選用柱前或柱后衍生的方式，來(lái)增加B1和G1的熒光響應(yīng)值，以滿足檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的需求。

目前常見(jiàn)的衍生方法有：TFA（三氟乙酸）柱前衍生法、柱后溴/碘試劑衍生法、柱后光化學(xué)衍生法以及柱后電化學(xué)衍生法。其中柱前衍生前處理過(guò)程較復(fù)雜、自動(dòng)化程度低，所以現(xiàn)在主流方式為柱后衍生法，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。

本應(yīng)用介紹了三種柱后衍生方案，使用賽里安LC6000高效液相色譜儀，配備高靈敏度的熒光檢測(cè)器（FL 6440）。三種方案均能滿足檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的需求，而從使用便捷性和靈敏度方面考慮，柱后光化學(xué)衍生法更為簡(jiǎn)便。

▼ 表1  2020版《中國(guó)藥典》檢測(cè)黃曲霉毒素的藥材品種

柱后碘衍生方案

參照2020年新版《中國(guó)藥典》2351通則中真菌毒素測(cè)定法，以0.05%的碘溶液為衍生試劑，使用賽里安 LC6000高效液相色譜儀四元梯度系統(tǒng)，搭配熒光檢測(cè)器和柱后衍生單元測(cè)定四種黃曲霉毒素。

色譜條件

標(biāo)準(zhǔn)譜圖示例

從譜圖可以看出，使用柱后碘衍生法測(cè)定，四種黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2得到了很好的分離，分離度均大于1.5，滿足藥典要求。

得益于賽里安 FL6440 高靈敏度的熒光檢測(cè)器，四種黃曲霉毒素的Z 低檢出限遠(yuǎn)小于2020藥典所規(guī)定的B1、G1檢出限0.5μg/kg（約0.30ng/mL）以及B2、G2檢出限0.2μg/kg（約 0.12ng/mL）。

▲ 柱后碘衍生法標(biāo)樣譜圖

▲ 柱后碘衍生法檢出限譜圖

柱后溴衍生方案

參考柱后溴衍生的檢測(cè)方法，使用50mg/L三溴化吡啶作為衍生試劑，同樣采用賽里安LC6000高效液相色譜儀四元梯度系統(tǒng)，搭配熒光檢測(cè)器和柱后衍生單元測(cè)定四種黃曲霉毒素。

色譜條件

標(biāo)準(zhǔn)譜圖示例

使用與碘衍生法相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，但是進(jìn)樣量有所差異。結(jié)果可見(jiàn)，B1、B2、G1、G2四種黃曲霉毒素同樣實(shí)現(xiàn)了基線分離。

從檢出限上看，B1和G1檢出限為0.03μg/kg（約0.075ng/mL），B2和G2檢出限為0.01μg/kg（約0.025ng/mL），實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全滿足。

▲ 柱后溴衍生法標(biāo)樣譜圖

▲ 柱后碘衍生法檢出限譜圖

柱后光化學(xué)衍生方案

與柱后溴/碘試劑衍生相比，柱后光化學(xué)衍生具備更好的易用性。配置上光衍生單元連接于色譜柱和熒光檢測(cè)器中間即可直接使用，同時(shí)無(wú)需配制任何化學(xué)試劑。操作簡(jiǎn)便的同時(shí)，靈敏度也能得到有效保證，特別適用于大量樣品的常規(guī)分析測(cè)定。

色譜條件

標(biāo)準(zhǔn)譜圖示例

配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：黃曲霉毒素B1和G1濃度0.1~50ng/mL、B2和G2濃度0.03~15ng/mL。按上述測(cè)試條件測(cè)試并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖所示），黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性相關(guān)性r2均為 0.9999。

可見(jiàn)，采用柱后光化學(xué)衍生結(jié)合熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，可以滿足法規(guī)對(duì)于黃曲霉毒素的檢測(cè)需要，并且相比其他方法更易與操作。

▲ 黃曲霉毒素B1和G1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

▲ 黃曲霉毒素B2和G2的標(biāo)準(zhǔn)曲線

▲ 柱后光化學(xué)衍生法標(biāo)樣譜圖

▲ 柱后光化學(xué)衍生法檢出限譜圖

結(jié)論

本應(yīng)用介紹了三種柱后衍生方案，均使用賽里安LC6000高效液相色譜儀（配備高靈敏度的熒光檢測(cè)器）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，且能夠滿足各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于黃曲霉毒素檢測(cè)的靈敏度要求，尤其是對(duì)藥材在生產(chǎn)儲(chǔ)存過(guò)程中的品質(zhì)把控提供了解決方案。

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