小針孔·大用途

針孔是共聚焦顯微拉曼的主要特征，與傳統(tǒng)光學(xué)顯微拉曼相比，在空間分辨率和成像對(duì)比度方面具有突出優(yōu)勢(shì)。

為什么針孔結(jié)構(gòu)是必須的？

當(dāng)激光通過拉曼顯微鏡聚焦到樣品中時(shí)，樣品內(nèi)部形成一個(gè)三維激發(fā)體。這個(gè)體積被稱為激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(PSF)。當(dāng)光匯聚到焦點(diǎn)處時(shí)，PSF的直徑減小，在焦點(diǎn)面上達(dá)到衍射極限的Z小直徑，然后隨著光的發(fā)散而增大直徑。PSF的真實(shí)形狀依賴于樣品的光學(xué)特性，如對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的透過率、折射率以及它如何散射入射的激發(fā)光。拉曼散射將發(fā)生在整個(gè)激發(fā)體中，僅僅從激發(fā)體測(cè)量拉曼光譜，會(huì)得到整個(gè)三維激發(fā)體的圖譜，但Z軸方向的信號(hào)會(huì)被削弱。

共聚焦中針孔的作用

共聚焦顯微鏡的針孔是為了在空間上過濾分析體（三維激發(fā)體），只檢測(cè)從焦平面產(chǎn)生的拉曼散射，產(chǎn)生于焦平面以上或以下的拉曼散射不會(huì)聚焦到共焦平面上，被共焦針孔遮擋而未被檢測(cè)到。與此相反，來自焦平面的拉曼散射被帶到共焦平面的焦點(diǎn)上，通過針孔并被檢測(cè)到（激發(fā)焦點(diǎn)內(nèi)部的拉曼散射也將聚焦在針孔處）。這就是“共聚焦”這個(gè)詞的意思。

光學(xué)縱向成像

使用共焦針孔的Z 大優(yōu)勢(shì)是它可以提供軸向(沿Z軸)分辨率。針孔將探測(cè)到的拉曼散射限制在以焦平面為中心的小體積薄片上。因此，顯微鏡可以聚焦到樣品內(nèi)部感興趣的深度，拉曼光譜能從選定的焦平面測(cè)量。通過移動(dòng)橫向(X-Y)平面掃描顯微鏡臺(tái)，可以創(chuàng)建焦平面區(qū)域的二維拉曼圖像，進(jìn)行樣品內(nèi)部的化學(xué)成分無(wú)損成像。針孔是必不可少的。如果沒有它，失焦的拉曼散射也會(huì)被檢測(cè)到，將導(dǎo)致圖像模糊和較差的軸向分辨率；針孔增加了圖像對(duì)比度，提高了軸向分辨率。

顯微鏡臺(tái)也可以沿著Z軸方向進(jìn)行移動(dòng)，以改變樣品內(nèi)焦平面的深度。拉曼光譜的變化以Z軸為基準(zhǔn)可以生成一個(gè)深度剖面，顯示化學(xué)成分的軸向變化。這特別適用于多層樣品的分析。PET和PVC聚合物具有獨(dú)特的拉曼光譜，拉曼縱向剖面圖可以識(shí)別PET-PVC-PET聚合物層狀分布。

圖1 PET-PVC-PET層狀聚合物拉曼縱向剖面圖像

在實(shí)際樣品測(cè)試時(shí)，橫向分辨率經(jīng)常受到較差圖像對(duì)比度的限制，而不是顯微鏡的衍射光學(xué)性能的限制。針孔技術(shù)提高橫向分辨率是通過抑 制雜散光來提高圖像的對(duì)比度。圖2顯示了硅質(zhì)基底上聚苯乙烯球的拉曼圖像，隨著針孔直徑的減少，球體的分辨率明顯改善。

圖2 不同針孔下（100μm和25μm）的硅質(zhì)基底聚苯乙烯球拉曼成像

使用共聚焦技術(shù)（針孔技術(shù)）的顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡相比，分辨率提高40%。針孔也能夠阻擋失焦散射和其他不需要的背景光，如熒光，減少了背景，增加了圖像對(duì)比度；顯著提高有效橫向分辨率。

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