蛋白糖基化是一種主要的翻譯后修飾 (PTM)，糖鏈的分布和組成可影響療 效和免疫原性。糖基化會受到許多不同因素的影響，并會發(fā)生一定程度的異質(zhì)性。因此，糖基化被認(rèn)為是必須控制以確保良好蛋白質(zhì)質(zhì)量的 CQA。

2025 年版《中國藥典》III 部新增了糖蛋白的糖基化分析等 5 個指導(dǎo)原則以及修訂了包括N糖譜測定法等近 20 個通則。這些新增指導(dǎo)原則與通則不斷提升標(biāo)準(zhǔn)的精確性與針對性，并補充了更精 準(zhǔn)的測定方法與分析技術(shù)，有力地確保了產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。

我們對糖基化分析指導(dǎo)原則（圖 1）和 N-糖譜測定法（表 1）更新總結(jié)如下：

表 1. 糖基化分析流程及方法

圖 1. N-糖譜分析通用方法

通過表 1，可以發(fā)現(xiàn)液相色譜/質(zhì)譜 (LC/MS) 系統(tǒng)已廣泛用于分析完整蛋白和亞基水平，肽段水平，以及表征  PTM。

安捷倫為糖基化提供完整糖蛋白、糖肽、寡糖、單糖的全面分析（圖 2）。包括：

■ 前處理平臺

■ Agilent 1290 Infinity III 液相色譜系統(tǒng)和 Agilent PLRP-S/AdvanceBio 專用色譜柱

■ Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 系統(tǒng)和/或熒光檢測器 (FLD)

■ 合規(guī)的數(shù)據(jù)處理軟件

圖 2. 安捷倫糖型/糖鏈表征工作流程

安捷倫 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

在蛋白糖基化表征中的應(yīng)用案例分享

根據(jù)蛋白的復(fù)雜性、與藥物安全有效的相關(guān)性以及生產(chǎn)監(jiān)控策略的總體設(shè)計等，安捷倫對不同水平的主要工作流程進行了相關(guān)研究。

Ⅰ.完整蛋白/亞基水平

在完整蛋白質(zhì)水平表征 mAb 糖型，是快速評價和監(jiān)控 mAb 糖基化最為常用的方法。以 NIST mAb 為例（圖 3），主要糖型均獲得了低至 ppm 級的誤差和出色的譜圖清晰度，同時可獲得主要糖型修飾的相對比例。其他較小的糖基化異質(zhì)性（例如 GlcNAc 殘基缺失），也可輕松鑒定。

圖 3. 完整 NISTmAb 的質(zhì)譜解卷積結(jié)果及主要糖型的相對定量（進樣量 0.5μg）

rhEPO（重組人促紅細(xì)胞生成素）是一種活性糖蛋白。由于其糖基化位點多，糖型結(jié)構(gòu)復(fù)雜，一直被視為糖基化表征的難題。從圖 4 可以看出，完整的 rhEPO 分子量分布在 30KDa 左右，而其氨基酸序列的分子量僅不到 20KDa，因此糖含量高達 50% 以上。

圖 4. 重組人促紅細(xì)胞生成素的質(zhì)譜解卷積結(jié)果

Ⅱ.亞基水平

使用 DTT 或 TECP，對蛋白進行還原，以便完全還原鏈間二硫鍵。使用 IdeS 酶對蛋白酶切后再還原，用 scFc 看糖型的類型和比例，亞基水平可以獲得比完整蛋白水平更豐富的糖型信息，也可以用做亞基的 MAM。

圖 5. Ideas 酶切 NIST mAb 還原后 scFc 解卷積結(jié)果

Ⅲ.糖肽水平

對于糖基化的位點研究，通常在肽段水平在進行。與 N-糖基化不同，O-糖基化往往會在同一條肽段上出現(xiàn)多個修飾位點，此種情況下使用優(yōu)先斷裂糖苷鍵 CID（碰撞誘導(dǎo)碎裂）的碎片，很難判斷修飾位點。ECD（電子捕獲碎裂）碎裂技術(shù)是在 2015 年由 e-MSion 公司研發(fā)。該公司于 2023 年成為安捷倫的一分子。ECD 碎裂時，多電荷的肽段在碎裂時完整保留了糖苷鍵，碎裂效率高，碎片信息豐富，可以用于糖基化位點的修飾分析。使用 6545XT QTOF 的 ECD 技術(shù)，對融合蛋白依那西普（Enbrel）的 O-糖基化位點進行了確認(rèn)，共鑒定到 12 個 O-糖基化位點，為 O-糖基化表征提供了技術(shù)依據(jù)（圖 6）。

圖 6. 依那西普肽段 SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPK 第 4, 7, 11, 12, 15, 16 和 25 位的 S/T 7 個 Core1 糖基化修飾 ECD 碎片及位點修飾判斷的關(guān)鍵碎片 c2,c4,c8,c10,c11,c12,c15,c16,c17,c32 和 z7

Ⅳ.游離寡糖水平（以N-糖譜為例）

在游離寡糖水平可以獲得全面豐富的蛋白寡糖類型結(jié)構(gòu)和含量信息。以游離N-糖分析為例，通過 Gly-X InstantPC 試劑盒，可以在 45min 內(nèi)實現(xiàn)蛋白的酶切、標(biāo)記到凈化。經(jīng)過色譜分離后，進行 LC-FLD/MS 的定量/定性分析（圖 7）。配合 PCDL 數(shù)據(jù)庫，可以覆蓋常見單抗和融合蛋白的 N-糖種類，使用方便。

圖 7.  InstantPC 標(biāo)記的西妥昔單抗 N-糖的 LC/FLD 色譜圖 (A)；根據(jù) MS 數(shù)據(jù)生成的提取化合物色譜圖表明熒光譜圖中有無法檢測到的聚糖峰 (B)

在游離寡糖水平的鑒別和定量工作中，含高唾液酸的糖蛋白藥物的寡糖結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，因此 2025 版《中國藥典》開發(fā)了針對的通用方法（圖 1）。安捷倫基于此開發(fā)了一種含高唾液酸糖蛋白藥物的游離寡糖分析方法，使用陰離子交換色譜柱，為這類分子的 N-糖定量提供可重現(xiàn)的高通量解決方案。以康柏西普為例（圖 8），該方案穩(wěn)定可靠，每個峰所帶的唾液酸數(shù)量均通過標(biāo)準(zhǔn)品定性，并獲得良好分離。

圖 8.  InstantPC 標(biāo)記的康柏西普樣品連續(xù)六次進樣的疊加色譜圖

唾液酸會影響蛋白藥物的半衰期和免疫原性，因此有必要對糖蛋白中的唾液酸進行測定。色譜法可以實現(xiàn)不同種類唾液酸的分離，專屬性強，且具有更高的靈敏度，因此，2025 版《中國藥典》對唾液酸的色譜法進行了補充。安捷倫唾液酸分析與定量解決方案線性范圍寬，定量限和檢測限結(jié)果良好，可用于糖蛋白中唾液酸的測定（圖 9）。

圖 9. DMB 標(biāo)記的 (A) Neu5Ac 質(zhì)譜圖；(B) Neu5Gc 質(zhì)譜圖；（C）西妥昔單抗的唾液酸 UHPLC 熒光譜圖；（D）Neu5Ac 和 Neu5Gc 校準(zhǔn)曲線和 LOD 及 LOQ

安捷倫生物藥糖基化分析中的優(yōu)勢

總結(jié)如下：

a、快速、完整的游離寡糖和單糖樣品前處理方案:

無需額外配備耗材，可快速完成樣品前處理。相比傳統(tǒng)的 2-AB 標(biāo)記，專 利的標(biāo)記試劑 InstantPC 熒光強度和質(zhì)譜響應(yīng)高 10 倍以上。

b、色譜分離：

1290 Infinity III Bio 超高效液相色譜儀系統(tǒng)采用生物兼容性流路，減少了待分析物與管路表面的非特異性相互作用。同時，Infinity Lab Assist 技術(shù)可以使工作效率提升 > 20%。針對不同類型的糖蛋白糖基化分析特點，專用的色譜柱確保快速、穩(wěn)定和可重現(xiàn)的色譜分離結(jié)果。

c、高靈敏度 QTOF：

AJS 離子源幫助更好的聚焦離子，提高離子化效率，從而提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。雙通道 ADC 檢測器保證了質(zhì)譜測量的質(zhì)量數(shù)和質(zhì)譜響應(yīng)的準(zhǔn)確度。

d、BioConfirm的合規(guī)性軟件平臺：

專用 Fragile Swarm Tune 模式，只需勾選糖譜 PCDL 庫和標(biāo)記物類型，即可進行糖譜的匹配。

參考文獻：

曹琰，趙雄，王曉娟等.2025 年版《中國藥典》三部增修訂概況[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2025,26(1): 28-33. doi: 10.19778/j.chp.2025.01.005

標(biāo)簽：安捷倫液相色譜系統(tǒng)