鐵硫簇（iron–sulfur cluster，鐵硫簇）是生物演化過(guò)程中最 早出現(xiàn)的、介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)的一類蛋白輔助因子，廣泛存在于線粒體、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核蛋白中，對(duì) DNA 復(fù)制與修復(fù)、線粒體呼吸、蛋白翻譯及鐵穩(wěn)態(tài)維持等生命過(guò)程至關(guān)重要。在哺乳動(dòng)物中，鐵硫簇合成障礙與多種遺傳性疾病密切相關(guān)，而鐵硫簇生物合成的上游調(diào)控機(jī)制，尤其是是否存在未知線粒體因子參與該合成代謝過(guò)程，至今尚未被完全闡明。

2025 年 12 月 18 日，清華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院朱佳俊課題組聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所潘巍峻課題組，在《Molecular Cell》期刊（IF=19.3）發(fā)表題為 “The TIM22 carrier translocase supports cell proliferation by facilitating mitochondrial iron uptake for Fe-S biogenesis” 的研究論文。該研究首次發(fā)現(xiàn)線粒體載體轉(zhuǎn)運(yùn)酶復(fù)合體 TIM22 是鐵硫簇（Fe-S）生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，其通過(guò)介導(dǎo)線粒體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的正確定位，保障鐵硫簇合成所需鐵離子供應(yīng)，進(jìn)而支持細(xì)胞增殖。該研究為 TIM22 復(fù)合體亞基突變相關(guān)神經(jīng)肌肉癥等疾病的致病機(jī)理解析及臨床治療策略開(kāi)發(fā)提供了全新線索。

整體研究策略

系統(tǒng)化篩選鐵硫簇生物合成調(diào)控的候選線粒體因子

構(gòu)建體外細(xì)胞模型驗(yàn)證調(diào)控因子作用

明確候選因子參與鐵硫簇合成的調(diào)控環(huán)節(jié)

驗(yàn)證候選因子的體內(nèi)生物學(xué)功能

研究結(jié)果

鐵硫簇生物合成相關(guān)基因篩選系統(tǒng)：CRISPR 報(bào)告基因系統(tǒng)

圖 1. CRISPR 篩選流程圖。在表達(dá) IRP2-EGFP 融合蛋白 HEK293T 細(xì)胞中，通過(guò)線粒體靶向 sgRNA 文庫(kù)開(kāi)展 CRISPR 基因敲除，若被敲除基因與鐵硫簇（Fe-S）生物合成相關(guān)，F(xiàn)BXL5 泛素連接酶（E3）活性會(huì)受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致 IRP2-EGFP 融合蛋白發(fā)生累積。借助流式細(xì)胞術(shù)分選并收集綠色熒光蛋白（EGFP）高表達(dá)的前 20% 細(xì)胞。通過(guò) gRNA 測(cè)序獲得確定候選基因。

鐵硫簇生物合成通路候選調(diào)控因子：線粒體載體轉(zhuǎn)運(yùn)酶復(fù)合體 TIM22

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò) CRISPR 基因編輯及報(bào)告基因篩選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) TIM22 復(fù)合體組分（包括 TIMM29 和 TIMM10）可能參與了鐵硫簇生物合成代謝通路；通過(guò)構(gòu)建基因缺陷細(xì)胞株，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)復(fù)合體組分功能缺失會(huì)導(dǎo)致鐵硫簇生物合成受損。

圖 2.（左）候選基因火山圖。（右）Western Blot 分析 HEK293T 細(xì)胞系中 TIM 復(fù)合體組分（TIMM29 和 TIMM10）表達(dá)缺陷對(duì)鐵硫簇簇合成的影響。

線粒體電子傳遞鏈的正常功能依賴多種含鐵硫簇蛋白及其鐵硫簇的電子接受和傳遞能力，其中，鐵硫簇生物合成受損會(huì)影響電子傳遞鏈的功能。研究團(tuán)隊(duì)采用了 Agilent Seahorse XFe 96 能量代謝分析儀對(duì) TIM22 復(fù)合體組分缺陷的細(xì)胞氧氣消耗率 (OCR) 進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞相比，TIM22 復(fù)合體組分缺陷細(xì)胞氧氣消耗率顯著下降，說(shuō)明電子傳遞鏈功能受損，這與細(xì)胞中鐵硫簇生物合成受損一致。

圖 3. 通過(guò) Seahorse 能量分析儀檢測(cè) TIMM 復(fù)合體組分缺陷下 DLD1 細(xì)胞的氧耗率 (OCR)。細(xì)胞先后經(jīng)過(guò)下面三種藥物處理：ATP 合酶抑制劑寡霉素（Oligomycin）、氧化磷酸化解偶聯(lián)劑羰基氰-4 (三氟甲氧基)苯腙（FCCP）及電子傳遞鏈抑制劑魚藤酮 / 抗霉素 A（Rot/Anti-A）。

TIM22 復(fù)合體通過(guò)維持線粒體 Fe2? 攝取，促進(jìn)鐵硫簇合成，進(jìn)而支持細(xì)胞增殖

線粒體中鐵硫簇的生物合成需要以半胱氨酸形式存在的硫、亞鐵狀態(tài)的鐵、由 NADPH 攜帶的電子，以及作為保護(hù)性還原力來(lái)源的谷胱甘肽（GSH）。因此，研究團(tuán)隊(duì)探究了 TIMM29 缺失情況下線粒體中半胱氨酸、鐵、NADPH 和 GSH 水平的變化，以闡明 TIM22 復(fù)合體對(duì)鐵硫簇生物合成的作用機(jī)制。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)離心法亞細(xì)胞分級(jí)分離或基于免疫純化的快速線粒體分離方法（Mito-IP）富集線粒體，并通過(guò) Agilent CG-MS 以及 Cytation 多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量線粒體組分中的代謝物豐度。結(jié)果顯示，在平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，半胱氨酸營(yíng)養(yǎng)限制培養(yǎng)、敲除線粒體膜谷胱甘肽轉(zhuǎn)運(yùn)體 SLC25A39、或敲除線粒體 NAD 激酶 NADK2 后，線粒體中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 的含量顯著降低。而 TIMM 復(fù)合體組分 TIMM29 缺失后，線粒體中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 水平幾乎沒(méi)有變化。這些結(jié)果表明：TIM22 復(fù)合體功能缺失并不會(huì)損害線粒體中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 的合成代謝通路。通過(guò)線粒體靶向亞鐵探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TIMM29 表達(dá)缺陷的細(xì)胞中線粒體鐵攝取能力降低。TIMM29 缺陷導(dǎo)致線粒體鐵攝取減少，且當(dāng)異種 TIMM29 被重新導(dǎo)入后，這一缺陷可被挽救。

圖 4.（上）針對(duì) HEK293T 中分離富集的線粒體，采用氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）檢測(cè)半胱氨酸水平；（中）采用酶偶聯(lián)比色測(cè)定法檢測(cè)谷胱甘肽（GSH）與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的水平。（下）Fe2+ 攝入實(shí)驗(yàn)及 HEK293T 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。樣本包含 TIM22 復(fù)合體組分缺陷株及異源鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體回補(bǔ)株。

TIM22 復(fù)合體生物體體內(nèi)功能：維持紅細(xì)胞譜系細(xì)胞發(fā)育及骨骼肌生成

研究團(tuán)隊(duì)利用 CRISPR 技術(shù)構(gòu)建 TIMM22 復(fù)合體組分 Timm29 基因敲除斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)突變體存在形態(tài)異常且胚胎期致死；其鐵硫簇相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著下降。胚胎受 精后 30 小時(shí)即出現(xiàn)血流無(wú)色、尾部造血組織紅細(xì)胞減少等造血缺陷表型。此外，突變胚胎骨骼肌纖維線粒體易發(fā)生碎片化。異位表達(dá)稻米鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體 OsMIT 可恢復(fù)鐵硫簇蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而挽救突變體的造血細(xì)胞譜系發(fā)育及骨骼肌發(fā)育缺陷。上述結(jié)果也證實(shí)“TIM22 - 線粒體鐵攝取 - 鐵硫簇合成” 調(diào)控軸的功能在脊椎動(dòng)物中高度保守。

圖 5. 在斑馬魚發(fā)育過(guò)程中，TIM22 復(fù)合體的核心功能是維持線粒體鐵攝取，以保障鐵硫簇的生物合成。

結(jié)論與展望

研究團(tuán)隊(duì)借助 CRISPR 報(bào)告基因篩選系統(tǒng)，篩選獲得鐵硫簇生物合成通路的候選調(diào)控因子 —— 線粒體載體轉(zhuǎn)運(yùn)酶復(fù)合體 TIM22，并體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)該復(fù)合體通過(guò)維持線粒體 Fe2? 攝取促進(jìn)鐵硫簇合成，進(jìn)而支撐細(xì)胞增殖；最后研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)斑馬魚模型證實(shí)該復(fù)合體在體內(nèi)具有維持紅細(xì)胞譜系細(xì)胞發(fā)育及骨骼肌生成的功能。

在本研究中，Agilent CG-MS 氣相質(zhì)譜、Seahorse 能量代謝分析系統(tǒng)、Cytation 多功能微孔板檢測(cè)儀及其他分析檢測(cè)平臺(tái)，助力研究團(tuán)隊(duì)交叉驗(yàn)證了 TIM22 復(fù)合體在線粒體鐵硫簇合成中的關(guān)鍵調(diào)控作用，并確認(rèn)了維持線粒體鐵攝取這一調(diào)控機(jī)制，為 TIM22 相關(guān)遺傳病的治療提供了新線索及策略。

標(biāo)簽：安捷倫