【概述】

鐵是細菌細胞內部進行各種生物過程所必須的金屬輔助因子。通常，鐵作為一種可YZ細菌生長的營養(yǎng)元素，細胞中

的總鐵含量限額取決于細胞的生長狀態(tài)和代謝需要。細菌已進化出復雜的系統來調節(jié)細胞中鐵含量。1細胞內多余的可溶性鐵是有毒的，這是由于過量的可溶性鐵產生會損傷細胞組分的活性氧，這意味著必須嚴格控制細胞中的鐵含量。然而，目前我們尚無法確定單個細胞內及整個細胞群內鐵含量的調節(jié)情況。在確定細胞生長條件和應激反應的影響時，包括因使用抗生素產生的應激反應，在近乎實時地測定細菌細胞中的鐵含量可提供關于細菌中鐵耐受限值的信息。有趣的是，某些具有殺菌作用的粘土礦物和粘土提取物中的可溶性鐵含量很高，這可能會破壞細菌細胞內的鐵平衡，導致細菌死亡。2此外，監(jiān)測單個細胞內的鐵含量還可了解細胞中鐵的分布情況，從而確定細胞群的同質性。

ICP-MS法可以分析成批培養(yǎng)的細菌細胞中的總金屬含量，然后根據測得的細胞總數平均算出單個細菌細胞的鐵含量。3由于平板計數法無法計算死亡細胞或未被培養(yǎng)的完整細胞，導致計數出現誤差。然而，由于儀器的限制，目前還未見有方法可直接分析單個細菌細胞中的鐵含量。

【實驗/設備條件】

【實驗/操作方法】

基于單細胞ICP-MS (SC-ICP-MS)分析技術取得的重大進展，使得直接測定單個細胞內金屬含量成為現實。PerkinElmer公司ZL的Asperon?單細胞霧室將單個完整細胞引入ICP-MS的等離子體中，結合NexION?系列ICP-MS質譜儀瞬時采集速度快的優(yōu)勢，可確定單個細菌細胞內的鐵含量。在本次實驗中，我們利用SC-ICP-MS法分別測定了三種菌株的單個細胞的鐵含量。這三個菌株分別是大腸桿菌B株(Eco)、枯草芽孢桿菌168株(BAC)和紅球菌RHA1株(RHA)。SC-ICP-MS技術可直接測定單個細胞的鐵含量，并確定每種菌株的鐵含量分布情況。鐵含量與細菌的細胞大小相關，即Zda菌株(RHA)單個細胞的平均鐵含量Z高，而Z小菌株(Eco)單個細胞的平均鐵含量Zdi。

細菌培養(yǎng)物

本次實驗分析了三種非致病性菌株，即大腸桿菌B株(Eco)，枯草芽孢桿菌168株(BAC)和紅球菌RHA1株(RHA)。根據以前的文獻報道，上述菌株的細胞尺寸分別約為2 μm、4 μm和10 μm±2。4-6在本次實驗中，平板分離的單克隆菌落分別接種于3個5mL的LB培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)，然后在振蕩培養(yǎng)箱中以200 rpm速度，37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌B株和枯草芽孢桿菌168株；在振蕩培養(yǎng)箱中以200 rpm速度，于30℃過夜培養(yǎng)紅球菌RHA1株。

從每種過夜培養(yǎng)物中取一份等分樣本(1 mL)，接入到已經預熱的含有250 mL LB培養(yǎng)基的燒瓶中，并將燒瓶放回振蕩培養(yǎng)箱中，使得菌落在上述條件下繼續(xù)生長。定期從每個燒瓶中取等分樣本(1 mL)，使用Cary 50 Bio紫外可見分光光度計

(Varian)監(jiān)測光密度(OD600)。大腸桿菌B株和枯草芽孢桿菌168株持續(xù)生長，直至進入后期對數生長期，Z終OD600分別為1.7和1.4。紅球菌RHA1株持續(xù)生長，直至進入后期穩(wěn)定期，Z終OD600為2.3。培養(yǎng)物被等分成1 mL樣本，并儲存在50%的甘油中于-20℃保存，然后進行SC-ICP-MS分析。菌落密度使用平板計數法進行單位體積菌落數統計。

SC-ICP-MS分析

將細菌細胞樣品（表1）放入35℃水浴中解凍1min，然后將樣品置于冰袋，使用1%磷酸鹽緩沖液(PBS)將樣品稀釋至含有100,000個細胞/mL-1的樣品稀釋液后立即上機SC-ICP-MS分析。樣品在使用前應單獨解凍，以防止細菌隨著時間推移而降解。SC-ICP-MS以dwell time50 μs（停留時間），每個樣品分析時間1min，重復測定三次。測試將消耗100 μL樣品。通過采用ICPMS的純氨氣通入反應池的模式（反應模式），消除ArO+對56Fe+的干擾。SC-ICP-MS工作條件見表2。

本次實驗利用濃度為50,000 part/mL的NIST 60 nm (8013)金納米顆粒標準物質，和濃度為33,000 part/mL的含有鑭系金屬（Ce、Eu、Ho和Lu）的Fluidgim 2.5 μm聚苯乙烯微球來測試方法傳輸効率(TE)。使用濃度分別為1、2和3 ppb的Fe離子標準液進行溶解離子校準。所有校準標準液的基質均與樣品基質匹配，均使用1% PBS制備。

ICP-MS分析

對于SC-ICP-MS分析，大腸桿菌B株、枯草芽孢桿菌168株和紅球菌RHA1株均生長至具有相同的光密度，并離心至一個細菌細胞聚合體上。然后，立即將樣品冷凍、冷凍干燥并混勻。稱取制備好的樣品(10 - 30 mg)放入Savillex? PFA中。加入Optima?級濃硝酸在電熱板上進行密閉消解。消解后將樣品加熱至近干，復溶于5 mL的0.05 M HNO3中。加拿大國家研究院的NRCC龍蝦肝胰臟(TORT-1)作為標準參考物質。使用純氨氣的反應模式分析56Fe（ICP-MS質譜儀的工作條件見表2）。

【實驗結果/結論】

對照樣本

本次試驗還分析了1%的PBS控制樣品和50%的甘油LB培養(yǎng)基空白樣品（上述樣本均按照細菌細胞樣品進行相同處理）。圖1表示1% PBS控制樣品和空白基質樣品的掃描結果，這兩份樣品均按照與細菌樣品相同的步驟進行處理。在這兩個樣品中，并未發(fā)現鐵的信號。

細菌測試

圖2表示細胞濃度為50,000個細胞/ mL時，大腸桿菌B株、枯草芽孢桿菌168株和紅球菌RHA1株的56Fe的信號掃描圖。結果表明，每種菌株的單個細菌細胞中56Fe平均含量不同，其中，大腸桿菌B株細胞中的56Fe含量Zdi，而紅球菌RHA1株細胞中的56Fe含量Z高。四種細菌單個細胞中Fe含量的百分比變化均相似。分裂旺盛的細胞群的差異性是造成細胞長度和每個細胞中鐵含量分布存在差異的原因。在細胞培養(yǎng)中，大多數細胞處于成熟的單細胞狀態(tài)，僅少數細胞經歷細胞分裂。在準備分裂時，細胞變大，從而將一個細胞分裂成兩個細胞。細胞群內的差異可能導致上述結果，其中大部分細胞處于正常范圍內，僅一小部分細胞變得更長且鐵含量更高。此外，紅球菌RHA1株細胞更易“聚集成群”，從少數的單細胞測定結果中可發(fā)現有兩個或以上細胞聚集成群。由此，在160-170 ag標記處顯示的第二個分布正對應兩個細胞聚集體。

細菌細胞經系列稀釋后進行測定，以測試細胞重疊現象（即兩個或以上細胞同時進入等離子體）。圖3A和3B表明，將細菌細胞稀釋至100,000、75,000和50,000個細胞/mL濃度時，單個細胞的鐵平均含量并沒有發(fā)生變化，反而每次稀釋后，細胞數量呈線性變化，結果表明，細胞濃度對細胞重疊無顯著影響。

圖2.表示細胞濃度為50,000個細胞/mL時，大腸桿菌B株、枯草芽孢桿菌168株和紅球菌RHA1株的56Fe的信號掃描圖，表明了單個細胞中鐵含量的分布情況。圖中顯示含有定量鐵（平均含量）的大腸桿菌B株、枯草芽孢桿菌168株和紅球菌RHA1株的細胞頻率，其中大腸桿菌B株的單個細胞平均鐵含量Zdi，而紅球菌RHA1株的單個細胞平均鐵含量Z高。

圖3.    (A)表示三種細菌樣品（大腸桿菌B株、枯草芽孢桿菌168株和紅球菌RHA1株）分別在100,000、75,000和50,000個細胞/mL稀釋液中，其預期細胞數量與單個細胞中鐵含量之間的關系。對于這三種細菌測試的所有樣品，樣品的細胞數量對單個細胞中鐵的含量幾乎沒有影響。(B) 100,000、75,000和50,000個細胞/mL稀釋液中預期細胞數量與各稀釋液中實際測得的細胞數量之間的關系。在有三種細菌的所有樣品中，給定稀釋液中預期細胞數量與實際測得的細胞數量呈線性關系。

鐵含量與細菌長度之間的關系

以三種菌株中細胞內平均鐵含量對每種菌株的測試長度作圖。菌株長度可用作衡量細菌數量的指標。圖4表明了細菌細胞中鐵含量與其長度之間呈線性關系。

圖4.以單個細菌細胞長度對應測得的單個細胞平均鐵含量作圖。從圖上可看出，細胞長度與測得的單個細胞內鐵含量之間呈正相關，其中長度Z長的細菌（紅球菌RHA1株），其細胞內鐵含量Z高，而長度Z短的細菌（大腸桿菌B株）中，其細胞內鐵含量Zdi。

結論

本次試驗證明，單細胞ICP-MS法可以準確定量單個細菌細胞中的鐵含量。此外，此方法還可以提供細菌培養(yǎng)物中的單個細胞內鐵分布信息。所建立的分析方法可以為嚴格控制細菌細胞的總鐵含量提供支持。SC-ICP-MS法還可用于在不同應激條件下生長的細菌細胞中鐵含量分布的測定。

【儀器/耗材清單】

NexION?系列ICP-MS質譜儀