本試劑盒中提供的2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)具有很強的擴增兼容性，不需要額外采用純化提取試劑去除裂解產物中的各種殘骸雜質，能直接以待測樣品裂解液為模板，進行高效特異性擴增。該試劑為2倍濃縮PCR反應混合液，包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，大大簡化擴增步驟的操作過程，降低污染機率。

該試劑盒可用于動物基因擴增檢測、轉基因動物基因型鑒定等。

組分信息

a）Lysis Buffer和 Proteases兩種組分配合使用于動物組織裂解。

b）2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)包含PCR擴增所需要的熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺等；已混有溴酚藍染料作為電泳指示劑，PCR產物可以直接進行電泳。

c）5×PCR Enhancer：高GC含量擴增（如大于65%）時，建議使用5×PCR Enhancer。

儲存條件

1. 試劑10184-A【Lysis Buffer】為動物組織裂解緩沖液，建議保存于2-8℃。

2. 試劑10184-B【Proteases】為動物組織裂解劑，使用時請勿長久開蓋，建議保存于-25~-15℃，避免反復凍融。

3. 試劑10184-C【2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)】，建議保存于-25~-15℃，避免反復凍融。

4. 試劑10184-D【5×PCR Enhancer】，建議保存于-25~-15℃，避免反復凍融。

試劑盒有效期1年。

使用說明

1. 在離心管中加入200 μL Lysis Buffer和2 μL Proteases，輕輕渦旋混勻。
2. 取約10 mg（長度2 mm左右）動物組織，置于上述離心管中，輕輕渦旋混勻。
3. 55℃孵育5-30 min，然后95℃處理5 min。
4. 12,000 rpm離心2 min。
5. 將上清轉移至新的離心管，-20℃保存或直接用于PCR擴增。

【注】

a）Lysis Buffer與Proteases混合后盡快使用，不宜長期保存；大量樣本操作時，可以將Lysis Buffer與Proteases按100 μL:1 μL的比例混勻備用。

b）組織應取少量并盡量剪碎，以便裂解反應更順利進行。各組織推薦使用量：鼠尾：長度2-4 mm；鼠趾：1-4個；鼠臟器、腦：直徑2-4 mm；斑馬魚、線蟲、果蠅等昆蟲組織：1-4個；細胞數量:10⁵-10⁸個。斑馬魚、線蟲、果蠅等較小樣本的組織，可適當減少Lysis Buffer至50-100 μL。昆蟲等外殼堅硬的樣本，建議剪碎樣本并增加Proteases至4 μL。

c）55℃孵育，一般5 min即可滿足多數PCR需求，如鼠尾、鼠耳等組織；若需要的DNA量較大或樣品較難裂解，可將時間延長至30 min或更久；裂解時間可在5-30 min之間調整，組織塊不需完全裂解，殘余的部分在后續(xù)離心步驟中可被除去。

6. 推薦PCR反應體系

表1 PCR反應體系

【注】：各組分使用前應充分混勻。

a）模板使用量：建議總體系的5-20%之間，避免超過總體系的20%。

b）引物終濃度：反應性能較差時，推薦在0.1- 0.5 μM范圍內調整引物濃度。

c）反應體系：推薦使用20 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

d）體系配制：配制好PCR反應體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應液集于管底。

e）對照反應：建議進行PCR時，設置陽性和陰性PCR對照反應以便于排除假陽性或假陰性的干擾。

7. 反應程序

表2 PCR反應程序

*退火溫度：請參考引物的理論Tm值，退火溫度可設置低于引物理論值5℃，或通過梯度PCR確定最佳溫度。

注意事項

1. 建議使用新鮮采取的動物組織，若為長期冷凍組織，應盡量避免反復凍融，否則會導致模板的降解，影響PCR效率。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3. 本產品僅作科研用途！

常見問題與解決方法

Ver.CN20241029