嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌，各種動物和昆蟲細胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3´末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結(jié)合后，不會參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC)，賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

嘌呤霉素在細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。

本品是無菌的、溶于蒸餾水的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液，濃度為10 mg/mL（10 mg/mL in H2O），可直接用培養(yǎng)基或其他緩沖溶液稀釋使用，適用于細胞培養(yǎng)，常用工作濃度為1~10 µg/mL。

 

產(chǎn)品信息

貨號	60209ES10/60209ES50/60209ES60/60209ES76
規(guī)格	1×1 mL/5×1 mL/10×1 mL/50×1 mL
CAS號（CAS NO.）	58-58-2
分子式（Molecular Fomular）	C22H29N7O5·2HCl
分子量（Molecular Weight）	544.43 g/mol
純度（Purity）	≥98%
外觀（Appearance）	溶液
濃度 （Concentration）	10 mg/mL（溶于水）
結(jié)構(gòu)（Structure）

 

組分信息

組分名稱	60209ES10	60209ES50	60209ES60	60209ES76
規(guī)格	1×1 mL	5×1 mL	10×1 mL	50×1 mL

 

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

1. 建議使用濃度

哺乳動物細胞：1~10 μg/mL，最佳濃度需要殺滅曲線來確定。推薦濃度，請看表1。

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。

【注】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細胞本身的影響。

表1 嘌呤霉素鹽酸鹽的推薦濃度

細胞系	嘌呤霉素濃度	參考文獻
B16（小鼠黑素細胞）	1~2 μg/mL	[1],[2]
HEK293（人胚胎腎細胞）	0.5~10 μg/mL	[3]
HeLa（人宮頸癌細胞）	1~10 μg/mL	[4]，[5]
MEF（小鼠成纖維細胞）	1-5 μg/mL	[4]
HepG2（人肝細胞癌）	0.5~5 μg/mL	[6]，[7]
A549（肺癌細胞）	1.5 μg/mL	[8]
人胚胎干 (ES) 細胞	0.5~5 μg/mL	[9]

2. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達的shRNA細胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線(kill curve)。

1）Day 1：24孔板內(nèi)以5~8×104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔，以確保后續(xù)的梯度實驗的進行，37℃細胞孵育過夜。

2）Day 2：①準備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0~15 μg/mL，至少5個梯度）；②往孵育過夜后的細胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細胞。

3）Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細胞存活率。

4）根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。

5）每日監(jiān)測細胞，觀察存活細胞率，確定抗生素篩選開始4~6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的藥物最低濃度。

3. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。

1）細胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細胞（原樣或稀釋）置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

【注】：當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用最明顯。細胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。最好進行細胞分盤使其密度不超過25%。

2）每隔2~3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3）篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。

【注】：每日進行細胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。

4）轉(zhuǎn)移和放置5~10個抗性克隆到一個35 mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細胞毒性實驗做準備。

 

注意事項

1.嘌呤霉素為有毒化合物，操作時請小心拿放。

2.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3.本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。

 

參考文獻

[1] Furge KA. et al., 2001. Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014.Rab5 is required in metastatic cancer cells for Caveolin-1-enhanced Rac1 activation, migration and invasion.. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Reward-based hypertension control by a synthetic brain-dopamine interface. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotic BID Is an ATM effector in the DNA-damage response Cell. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) induces a CCR5-dependent accelerated shedding of syndecan-1 (CD138) and syndecan-4 from HeLa cells and forms

[6] Gao J , Zhao N , Knutson M D , et al. The Hereditary Hemochromatosis Protein, HFE, Inhibits Iron Uptake via Down-regulation of Zip14 in HepG2 Cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(31):21462-8.

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[8] Nasser M W , Datta J , Nuovo G , et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KDown-regulation of micro-RNA-1 (miR-1) in lung cancer. Suppression of tumorigenic property of lung cancer cells and their sensitization to doxorubicin-induced apoptosis by miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero A O , Hilkka T , Happonen L J , et al. Bacteriophage Mu integration in yeast and mammalian genomes[J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36(22):e148-e148.

 

客戶使用本產(chǎn)品發(fā)表的科研文獻（部分）

[1] Zhang D, et al. A non-canonical cGAS-STING-PERK pathway facilitates the translational program critical for senescence and organ fibrosis. Nat Cell Biol. 2022 May;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 May 2. PMID: 35501370.

[2] Lu T, et al. CD73 in small extracellular vesicles derived from HNSCC defines tumour-associated immunosuppression mediated by macrophages in the microenvironment. J Extracell Vesicles. 2022 May;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[3] Chen S, et al. Identification of ubiquitin-specific protease 32 as an oncogene in glioblastoma and the underlying mechanisms. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[4] Han L, et al. Uterus globulin associated protein 1 (UGRP1) binds podoplanin (PDPN) to promote a novel inflammation pathway during Streptococcus pneumoniae infection. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[5] Sun Q, et al. MORTALIN-Ca2+ axis drives innate rituximab resistance in diffuse large B-cell lymphoma. Cancer Lett. 2022 Jul 1; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35447282.