目的

美國(guó)藥典第<86>章允許使用非動(dòng)物來(lái)源的試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，包括使用重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR，Recombinant Cascade Reagent）和重組C因子試劑（rFC，Recombinant Factor C）。本文展示了Sievers? Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素（BET，Bacterial Endotoxins Testing）檢測(cè)儀與rCR試劑在化驗(yàn)各種藥品時(shí)的適用性和相容性，為鱟試劑（LAL，Limulus Amoebocyte Lysate）細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)提供了高效、非動(dòng)物來(lái)源的替代方法。

我們對(duì)7種已發(fā)布的市售產(chǎn)品進(jìn)行了方法適用性和優(yōu)化分析。我們用Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀運(yùn)行了一個(gè)批次的市售重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR），并對(duì)比了同一生產(chǎn)商的動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑。在本研究中測(cè)試的7種市售產(chǎn)品列于表1中。

表1：用Eclipse測(cè)試的產(chǎn)品

背景信息

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀采用動(dòng)態(tài)方法來(lái)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線和最多21個(gè)帶陽(yáng)性對(duì)照（PPC，Positive Product Controls）的樣品。Sievers Eclipse微孔板預(yù)置來(lái)自參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（RSE，Reference Standard Endotoxin）的標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照（PPC），用戶僅需使用1 mL的鱟試劑即可運(yùn)行每次最多5點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（范圍：50 – 0.005 EU/mL）的化驗(yàn)。

市售的rCR試劑與顯色法試劑類似，具有LAL級(jí)聯(lián)結(jié)構(gòu)。本研究旨在確定這種rCR試劑在進(jìn)行現(xiàn)實(shí)生活樣品測(cè)試時(shí)的表現(xiàn)是否確實(shí)與傳統(tǒng)的動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑相似。我們用Sievers Eclipse對(duì)每種產(chǎn)品分別使用rCR試劑和動(dòng)態(tài)顯色法試劑進(jìn)行測(cè)試。

樣品制備和實(shí)驗(yàn)測(cè)試計(jì)劃

我們通過(guò)測(cè)試不同稀釋倍數(shù)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（LRW，LAL Reagent Water）來(lái)對(duì)全部產(chǎn)品進(jìn)行初步篩選，以確定哪種稀釋度可以實(shí)現(xiàn)最 佳PPC回收率和克服樣品干擾。我們分析的稀釋倍數(shù)包括1:1、1:10、1:20、1:50、1:100。表2是初步篩選出來(lái)的各種試劑類型的品名和稀釋倍數(shù)。在測(cè)試產(chǎn)品時(shí)，我們對(duì)胰島素、紅霉素、氯化鉀進(jìn)行了多種稀釋倍數(shù)的測(cè)試，以便在完成產(chǎn)品篩選后得到更多的結(jié)果并克服樣品干擾。

標(biāo)準(zhǔn)品和產(chǎn)品的接受標(biāo)準(zhǔn)如下：

• 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、陽(yáng)性對(duì)照（PPC）的變異系數(shù)百分比（CV%）：≤ 15%

• PPC回收率：50-200%

• R值：≥ -0.980的絕 對(duì)值
  

表2：產(chǎn)品的稀釋倍數(shù)

測(cè)試結(jié)果

測(cè)試結(jié)果總結(jié)如下。表3和表4是標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，表5-10是樣品的結(jié)果。

標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表3：動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑的5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果：使用Sievers Eclipse測(cè)試

表4：重組級(jí)聯(lián)試劑的5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果：使用Sievers Eclipse測(cè)試

樣品結(jié)果

氯化鉀

表5：Sievers Eclipse測(cè)試的氯化鉀液結(jié)果（每個(gè)板上有3或5份重復(fù)樣品）

紅霉素

表6：Sievers Eclipse測(cè)試的紅霉素液結(jié)果（每個(gè)板上有3或5份重復(fù)樣品）

*一個(gè)重復(fù)樣品有分孔

**所有3個(gè)重復(fù)樣品中都有分孔

***一個(gè)重復(fù)樣品的%CV > 15

5%葡萄糖

表7：Sievers Eclipse測(cè)試的5%葡萄糖液結(jié)果（每個(gè)板上有3份重復(fù)樣品）

0.9%氯化鈉

表8：Sievers Eclipse測(cè)試的0.9%氯化鈉液結(jié)果（每個(gè)板上有3份重復(fù)樣品）

乳酸林格氏液

表9：Sievers Eclipse測(cè)試的乳酸林格氏液結(jié)果（每個(gè)板上有3份重復(fù)樣品）

人胰島素注射液

表10：Sievers Eclipse測(cè)試的人胰島素注射液結(jié)果（連續(xù)編號(hào)的板上有3、5或6份重復(fù)樣品）

*一個(gè)重復(fù)樣品有分孔

注射用水

表11：Sievers Eclipse測(cè)試的注射用水結(jié)果（每個(gè)板上有3份重復(fù)樣品）

結(jié)論和建議

對(duì)于本研究中的大多數(shù)現(xiàn)實(shí)生活樣品類型來(lái)說(shuō)，Sievers Eclipse與市售的重組級(jí)聯(lián)試劑有極 佳的適用性和相容性。紅霉素和胰島素樣品均有多個(gè)分孔，很可能是由于樣品干擾。如果實(shí)驗(yàn)室考慮使用非動(dòng)物來(lái)源的試劑進(jìn)行符合USP <86>標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，則可以用Sievers Eclipse微孔板來(lái)優(yōu)化rCR試劑。

為了便于以后分析，在比較rCR試劑和鱟試劑時(shí)，必須進(jìn)行樣品篩選以確定每種產(chǎn)品的最 佳稀釋倍數(shù)。當(dāng)有更多批次的市售試劑可用時(shí)，也應(yīng)對(duì)其進(jìn)行測(cè)試以確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。