分子雜交（molecular hybridization）是指使單鏈核酸堿基序列確定的技術(shù)。待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對使可檢出的雙螺旋片段形成為分子雜交的基本原理。下面就讓小編帶你了解一下雙鏈DNA探針標記法中的隨機引物合成法。

概念

將DNA模板和寡核苷酸引物結(jié)合經(jīng)過Klenow酶的作用使得DNA探針合成，合成的DNA探針即為隨機引物合成雙鏈探針。反應(yīng)中酶的量、dNTP、模板、引物對合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性均會產(chǎn)生影響。產(chǎn)物的平均長度一般是400-600個核苷酸。

操作準備：

設(shè)備：恒溫水浴鍋、高速臺式離心機等。

材料：待標記的DNA片段。

試劑：緩沖液A；[α-32 P] dATP；20mmol/L DTT；Klenow片段；10×隨機標記緩沖液；隨機引物。

具體操作：

混合1μl 7.5ng隨機引物以及1μl 200ng雙鏈DNA，然后將混合液放入eppendorf管中，先進行5min水浴煮沸，再立刻進行1min冰浴。將1μl ddH2O，3μl[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl)，1μl 10×隨機標記緩沖液，1μl 未標記的dNTP溶液以及1μl 20mmol/L DTT在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內(nèi)混合。在后管中移入前管中的溶液。將5單位Klenow片段加入到管中，充分混合,使用微型離心機通過12000g離心1-2秒, 從而使得所有溶液在試管底部沉著，室溫環(huán)境中保溫3-16h。將10μl緩沖液A加入到反應(yīng)液中，在-20℃下保持放射性標記的探針以備使用，與此同時將放射比活性計算出來。

注意事項

1.模板DNA應(yīng)當為線性的。

2.需要認真調(diào)整引物與模板的比例，如果引物比模板高，那么會得到較短片段的探針，然而累積較多的產(chǎn)物；相反，則反應(yīng)產(chǎn)物比較長。

優(yōu)點：

使用隨機引物反應(yīng)的優(yōu)點如下：

1.在低熔點瓊脂糖中，隨機引物也能夠直接進行反應(yīng)。

2.反應(yīng)產(chǎn)物具有比較到的比活性，比活性能夠達到4×109 cpm/μg探針。

3.即使使用的質(zhì)粒DNA模板微量也能夠進行反應(yīng)，其在反應(yīng)時對模板沒有較為嚴格的要求。

4.5'→3'外切酶活性不為Klenow片段所具備，能夠穩(wěn)定地進行反應(yīng)，從而使大量的有效探針得以獲得。