分子雜交（molecular hybridization）是指使單鏈核酸堿基序列確定的技術(shù)。待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對使可檢出的雙螺旋片段形成為分子雜交的基本原理。下面就讓小編帶你了解一下用Klenow片段合成單鏈探針的操作方法。

概念

可以在噬?；騇13噬菌體載體中通過從M13載體衍生序列合成的單鏈DNA探針克隆模板序列，放射標記探針可以在[a-32P]-dNTP的存在下，引物為特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸以及以上述為模板通過lenow片段作用合成，一部分雙鏈分子在完成反應后得到。這些長短不一的產(chǎn)物可以在克隆序列內(nèi)或下游用限制性使用內(nèi)切酶進行切割，再使用變性凝膠電泳分離開模板和探針。

操作準備：

試劑：0.5mol/L EDTA （pH8.0）；適宜的限制；Klenow片段；dCTP,dTTP,dGTP溶液；未標記的dNTP溶液；[α-32 P] dATP；0.1mol/L DTT溶液；10×Klenow緩沖液。

設(shè)備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。

材料：已制備好的單鏈DNA模板。

操作步驟：

在0.5ml eppendorf管中將3ml 10×Klenow緩沖液，5pmol適當引物以及1mg單鏈模板加水混合成20ml溶液。加熱eppendorf管到85℃5min，在半個小時之內(nèi)，降低小離心管的溫度到37℃。將2ml，5ml[a-32P]dATP，1ml未標記dATP以及1mldGTP,dCTP,dTTP混合液混勻之后，稍微離心從而使其在試管底部沉淀。將1ml（5單位）Klenow酶加入在室溫下30min，將1ml20mmol/L未標記的dATP溶液加入在室溫下30min，將溶液加熱到68℃10min，從而使得Klenow片段失活，為了適合酶切，對NaCl的濃度進行調(diào)整。將20單位限制性內(nèi)切酶加入，酶切1h.使用酚/氯仿抽提DNA，加入乙醇沉淀從而將dNTP去除或者將0.5mol/L EDTA(pH8.0)加入知道，溶液的濃度為10mmol/L為止。放射性標記的探針使用電泳方法分離。