WB實(shí)驗(yàn)是什么？
WB實(shí)驗(yàn)又稱Western Blot（蛋白質(zhì)免疫印跡），通過(guò)抗原抗體雜交原理，使用一抗二抗雜交再最后通過(guò)顯影檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量。WB是分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)中檢測(cè)特定蛋白質(zhì)、半定量分析蛋白表達(dá)量的核心技術(shù)。也是分子生物學(xué)必需和最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)。幾乎生物類文獻(xiàn)都提供了WB實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)支持。
WB實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是什么？
在一篇文獻(xiàn)中WB實(shí)驗(yàn)一般通過(guò)條帶圖來(lái)體現(xiàn)。形式如下圖所示。其中科學(xué)家們會(huì)分類分組對(duì)比不同藥物處理和分組細(xì)胞系等條件設(shè)置對(duì)比，來(lái)檢驗(yàn)蛋白條帶表達(dá)的區(qū)域。一般至少設(shè)置一個(gè)對(duì)照組（Actin或者GAPDH內(nèi)參蛋白檢測(cè)）和一個(gè)實(shí)驗(yàn)組（目的蛋白）。
通過(guò)印跡雜交后調(diào)整各組實(shí)驗(yàn)內(nèi)參蛋白的表達(dá)量（內(nèi)參蛋白歸一化）后，再對(duì)比各自表達(dá)量。如果檢測(cè)相關(guān)蛋白信號(hào)通路如AKT磷酸化（P-AKT）的表達(dá)，還會(huì)額外增加AKT本底蛋白作為陰性對(duì)照組檢測(cè)蛋白的磷酸化水平。
通過(guò)觀察條帶的寬度濃度來(lái)判斷蛋白的含量和位置。其中必不可少的是進(jìn)行蛋白條帶原始TIF圖（矢量圖）的灰度值分析?？梢孕纬娠@著性差異的柱狀數(shù)據(jù)分析圖（如下圖）。從而從數(shù)據(jù)上真實(shí)檢測(cè)和計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。
多重?zé)晒鈝estern blot法檢測(cè)心肌組織損傷局部蛋白Troponin c/l
圖片數(shù)據(jù)清晰，文件不小于300個(gè)DPI
需要進(jìn)行灰度值精準(zhǔn)定量數(shù)據(jù)分析（不可僅憑肉眼觀察）
提供原始文件TIF原圖（8 bit---16 bit（最通用版本）----24 bit）
盡可能整張膜進(jìn)行顯影（膜拼接）
過(guò)曝?cái)?shù)據(jù)不能使用（紅色/紫紅色區(qū)域）
不建議同一批實(shí)驗(yàn)更換條件（ECL/成像儀）減少誤差
磷酸化等高靈敏實(shí)驗(yàn)可建議使用熒光成像
gamma調(diào)節(jié)必須不能動(dòng)！為1！
蛋白條帶濃度分析不能使用圖片格式（jpeg/bmp）及與marker疊加圖，需使用單個(gè)wb條帶原始TIF（矢量圖）源文件
需進(jìn)行內(nèi)參蛋白歸一化或者總蛋白歸一化計(jì)算
蛋白條帶及峰圖面積積分注意一定要進(jìn)行背景去除?。ㄈコ胍艉捅尘案蓴_）
使用什么工具進(jìn)行WB數(shù)據(jù)分析？
建議使用專業(yè)的圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。如imageJ，ImageQuant TL analysis software（IQTL）等官方認(rèn)可科研分析軟件進(jìn)行圖像分析。
如果使用第三方軟件如PS，美圖秀秀等可能會(huì)導(dǎo)致原始TIF如bit 16 TIF （0-65535灰階）被壓縮到bmp格式（ 0-255）灰階，數(shù)據(jù)會(huì)被丟失或者失真，造成條帶邊緣信息模糊等。
泳道劃分
背景去除（根據(jù)閾值）
條帶劃分（根據(jù)峰圖）
MW分子量計(jì)算（可選）
歸一化計(jì)算（可選）
Quant定量計(jì)算（可選）
結(jié)果讀取和數(shù)據(jù)輸出
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