當(dāng)前，臨床流式細(xì)胞分析已成為檢驗醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個熱點，其發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

一．從相對細(xì)胞計數(shù)到細(xì)胞計數(shù)

流式細(xì)胞分析Zda的優(yōu)點是對混合細(xì)胞群體中亞群細(xì)胞的計數(shù)，如淋巴細(xì)胞可依其表面標(biāo)志的不同分為T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD19+）、NK細(xì)胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細(xì)胞又可進(jìn)一步分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）和YZ/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細(xì)胞計數(shù)過去多以相對百分比表達(dá)結(jié)果，由于百分比只能代表每種細(xì)胞在混合細(xì)胞群體中所占的比例，并不能體現(xiàn)其在單位體積血液中的數(shù)量，而對艾滋病等一些疾病的臨床診斷，有時需要考慮細(xì)胞的數(shù)量，如患者血液中T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）的數(shù)量<200個/μL，而未發(fā)病（僅有HIV感染）者的數(shù)量>200個/μL。T淋巴細(xì)胞亞群的計數(shù)在國外實驗室早已成為常規(guī)檢查，但在國內(nèi)僅有少數(shù)實驗室開展?？梢灶A(yù)見，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，對造血干細(xì)胞等的數(shù)量分析，不久的將來，也將作為常規(guī)檢查項目，走出實驗室進(jìn)入臨床。

流式細(xì)胞計數(shù)在臨床可開展的項目包括：①淋巴細(xì)胞亞群，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群的計數(shù)。②外周血或骨sui中造血干/祖細(xì)胞的計數(shù)。③血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的計數(shù)。④血液中血小板數(shù)量，尤其是血小板減少癥患者血小板的計數(shù)，此種計數(shù)優(yōu)于血細(xì)胞分析儀法，已成為血小板計數(shù)的國際推薦參考方法。此外，可能出現(xiàn)在血液中的其它一些稀少細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞等）的計數(shù)，也將發(fā)展為流式細(xì)胞計數(shù)。流式細(xì)胞計數(shù)的開展對臨床疾病的診斷、ZL等有重要意義。

二．從相對定量到定量分析

細(xì)胞的多種成分如某些抗原或受體表達(dá)的流式細(xì)胞分析，以前多以平均熒光強度（MFI）或相對熒光強度（RFI）表達(dá)其含量。由于流式細(xì)胞儀每次的儀器狀況可出現(xiàn)差異，每個實驗室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細(xì)胞抗原或受體的表達(dá)量缺乏可比性，雖然流式細(xì)胞儀有極高的熒光靈敏度，但卻無法準(zhǔn)確應(yīng)用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細(xì)胞的某些成分，定量流式細(xì)胞術(shù)（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發(fā)展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數(shù)的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數(shù)的混合微球，此微球與待測標(biāo)本在相同條件下與熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）反應(yīng)后在流式細(xì)胞儀上測定其熒光強度，根據(jù)微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數(shù)和與之對應(yīng)的對數(shù)熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本中陽性細(xì)胞的對數(shù)熒光強度代入方程即可求得其每個細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)（抗原結(jié)合位點數(shù)）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同數(shù)量熒光素分子的混合微球。在流式細(xì)胞儀儀器設(shè)置相同的條件下測定此微球及待測細(xì)胞的熒光強度，根據(jù)微球上所包被的熒光素分子數(shù)和與之對應(yīng)的對數(shù)熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本陽性細(xì)胞的對數(shù)熒光強度代入方程，可求得每個細(xì)胞上的平均熒光素分子數(shù)，根據(jù)用于樣本測定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結(jié)合的分子比例，計算每個細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)。單細(xì)胞的抗原或受體定量是流式細(xì)胞分析的重要進(jìn)展，為細(xì)胞的生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)等研究提供了更精確的方法。例如，白血病原始細(xì)胞膜的CD45分子表達(dá)量低于正常淋巴細(xì)胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數(shù)顯著高于靜止血小板，活化淋巴細(xì)胞的CD69分子數(shù)顯著，活化中性粒細(xì)胞膜CD64分子數(shù)顯著高于靜止中性粒細(xì)胞，強直性脊柱炎患者T淋巴細(xì)胞膜HLA-B27分子數(shù)明顯。CD8+T淋巴細(xì)胞膜的CD38分子數(shù)是慢性HIV感染者病情發(fā)展或死亡的更有力的預(yù)后指標(biāo)；AIDSZL有效后，CD8+T淋巴細(xì)胞CD38分子數(shù)顯著降低。

三．從單色到多色熒光分析

流式細(xì)胞分析已從Z初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發(fā)展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對細(xì)胞亞群的識別和分選、細(xì)胞功能評價等更為精確。目前，淋巴細(xì)胞亞群的分析、白血病免疫表型分析，均應(yīng)使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細(xì)胞白血病的異常淋巴細(xì)胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢，有條件時應(yīng)盡可能地采用。

四．從細(xì)胞膜成份到細(xì)胞內(nèi)成份分析

細(xì)胞膜免疫表型分析是Z重要的流式分析內(nèi)容之一，很多細(xì)胞亞群的檢測和分選均是以細(xì)胞膜的免疫表型特征為依據(jù)，如T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對一些細(xì)胞的系列鑒定和功能狀態(tài)分析常常較為困難，而細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)成份的分析則更能反映某些細(xì)胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細(xì)胞內(nèi)成分檢測技術(shù)的不斷完善，細(xì)胞內(nèi)成分檢測已成為流式細(xì)胞分析的又一個熱點。例如，急性髓系白血病性原始細(xì)胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是Z為準(zhǔn)確的系列標(biāo)志，急性B淋巴細(xì)胞白血病性原始細(xì)胞胞漿中檢測到CD79a是Z為特異的系列標(biāo)志；檢測T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達(dá)，是判斷T淋巴細(xì)胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（Th）進(jìn)一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細(xì)胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細(xì)胞內(nèi)成分檢測技術(shù)與多色免疫熒光分析方法相結(jié)合，可檢測不同細(xì)胞亞群合成的不同細(xì)胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后，輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞亞類—Th1細(xì)胞內(nèi)有細(xì)胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。

五．液體中可溶性成分的流式細(xì)胞分析

從傳統(tǒng)意義上講，流式細(xì)胞技術(shù)只能分析細(xì)胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進(jìn)行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結(jié)合在一種類似于細(xì)胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細(xì)胞儀便可以對其進(jìn)行分析，這就是近年來發(fā)展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術(shù)。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測液體中的相應(yīng)成分反應(yīng)形成抗原與抗體的復(fù)合物，再加入熒光素標(biāo)記的第二抗體，微球上結(jié)合的待測抗原或抗體分子數(shù)量與其熒光強度呈線性關(guān)系，由此可對待測液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對應(yīng)的成分進(jìn)行定性或定量分析，例如同時測定血清或細(xì)胞培養(yǎng)液中的多種細(xì)胞因子，同時測定血清中多種自身抗體。CBA發(fā)展的時間雖很短，目前所能檢測的項目還不多，但其發(fā)展?jié)摿Σ蝗莺鲆?。已知檢測細(xì)胞因子的方法有多種，包括靶細(xì)胞功能分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、斑點酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度極高、可達(dá)2pg/ml，而且能同時測定單個標(biāo)本中的多種細(xì)胞因子。

六．分子表型分析

分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。流式分子表型分析與免疫表型分析技術(shù)相結(jié)合，為所選擇細(xì)胞亞群的特異性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）檢測提供了一種非常有用的工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。流式分子表型與免疫表型分析結(jié)合的基本技術(shù)路線是：①待測細(xì)胞首先與特異性細(xì)胞亞群的單克隆抗體反應(yīng)，②固定并滲透細(xì)胞，③通過PCR進(jìn)行引物特異的核酸序列擴增，④應(yīng)用對擴增產(chǎn)物的特異性寡核苷酸熒光素標(biāo)記探針進(jìn)行熒光原位雜交（FISH），⑤加入針對細(xì)胞亞群單抗的熒光素標(biāo)記的第二抗體。⑥流式細(xì)胞儀檢測及數(shù)據(jù)分析。例如，流式細(xì)胞免疫表型與聚合酶鏈反應(yīng)及熒光原位雜交（PCR-FISH）結(jié)合測定血液CD4+細(xì)胞中HIV特異的DNA或RNA，對于AIDS的病程監(jiān)測、ZL反應(yīng)以及預(yù)后等具有重要價值。

流式熒光原位雜交（Flow-FISH）法可測定染色體端粒長度。細(xì)胞的染色體端粒是由2~20Kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n和一些結(jié)合蛋白組成，端粒長度越長，所含重復(fù)堿基數(shù)目越多；用熒光素標(biāo)記的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特異性探針進(jìn)行FISH后，端粒的長短可以流式細(xì)胞儀檢測到的熒光強度的高低反映出來；Flow-FISH測定精度可小于3Kb的端粒長度差，對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、ZL與預(yù)后等的研究有一定價值。