在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）利用一種特殊的緩沖液（兩性電解質）將一個pH梯度制造而成，電泳時每種蛋白質將在等于其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質不再帶有凈的正或負電荷）聚集從而使得一個很窄的區(qū)帶形成的一種電泳方法，就是等電聚焦電泳（Isoelectric focusing (IEF), also known as electrofocusing）。

基本原理

在IEF的電泳中，從陽極到陰極分布著具有pH梯度的介質，pH值逐漸增大。兩性解離及等電點的特征為蛋白質分子所具備。如此，在堿性區(qū)域，帶負電荷的蛋白質分子向陽極移動，直至某一pH位點時電荷失去了而使移動停止，這個地方介質的pH正好和聚焦蛋白質分子的等電點（pl）相等。同理，在酸性區(qū)域，帶正電荷的蛋白質分子蛋白質分子直到它們的等電點上聚焦為止。由此可知，在此方法中，蛋白質組分的特性量度為等電點，在有pH梯度的凝膠介質中加入等電點不同的蛋白質混合物，在電場內經過一定時間后，各組分在在各自等電點相應的pH位置上聚焦，從而使得分離的蛋白質區(qū)帶形成。

載體介質

如果兩性電解質載體足夠理想，那么其在pI處的緩沖能力及電導足夠，前者使pH梯度的穩(wěn)定得到保證，后者允許通過一定的電流。為了使整個體系的電導均勻，不同pI的兩性電解質的電導系數應該相似。兩性電解質的分子量要小，如此，就能夠很容易地應用分子篩或透析方法分開其與被分離的高分子物質，并且不應該使其變性和被分離物質發(fā)生反應。

梯度組成

pH梯度有人工pH梯度和天然pH梯度二種pH梯度組成方式，因為人工pH梯度重復性差，和不穩(wěn)定，所以現在已經看不見使用了。天然pH梯度的建立是將等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物在水平板或電泳管正負極間引入，將酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等在正極端引入，將堿液，如氫氧化鈉、氨水等負極端引入堿液。

開始電泳前，兩性電解質的混合物pH為一均值，就是各段介質中的pH相等，用pH0表示。當開始電泳后，帶負電荷Z多的為混合物中pIZdi的分子，pI1為其等電點，向正極移動速度Z快，當移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至和PI1接近或者比PI1還稍低，這一分子不再向前移動而是在此區(qū)域內停留。因為兩性電解質具有一定的緩沖能力，從而保持其周圍一定的區(qū)域內介質的pH在它的等電點范圍。第二種兩性電解質pH稍高，其等電點為pI2，也向正極移動，因為pI2>pI1，所以定位于diyi種兩性電解質之后，如此，經過一定時間后，按各自的等電點具有不同等電點的兩性電解質依次排列，使得從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度形成。