PCR是聚合酶鏈式反應的簡稱，是一種酶促化學反應，可以在試管里將待測的目的基因在很短的時間內擴增五十萬倍乃至上百萬倍，大大提高了基因診斷的靈敏度，降低了分析的難度。PCR法是目前基因診斷中使用Z多的方法。下面就讓小編帶你了解一下PCR的反應流程。

PCR反應流程

1.溫度與時間的設置

對變性-退火-延伸三個溫度點進行設置。在標準反應中，采用三溫度點法，當溫度為90-95攝氏度時，雙鏈DNA變性，再將溫度迅速降低到40-60攝氏度退火，Z后將溫度提升到70-75攝氏度延伸。對于長度為100-300bp的短靶基因，可以采用二溫度點法，就是將退火和延伸的溫度合二為一，通常在94攝氏度變性，在65攝氏度左右退火和延伸。

（1）變性溫度和時間

變性的溫度通常為93-94攝氏度，使模板變性的時間1分鐘足夠，如果溫度小于93攝氏度，那么需要適當延長時間。然而溫度不能夠過高，否則會影響酶的活性。

（2）退火溫度與時間

退火溫度會對PCR特異性產生重大的影響。靶基因序列的長度、堿基組成和濃度以及引物的長度決定了退火的溫度和時間。

在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可以使得引物和模板間的非特異性結合大大減少，從而使得PCR反應的特異性提高。

（3）延伸溫度與時間

延伸的溫度通常在70-75攝氏度之間選擇。72攝氏度為延伸常用的溫度，如果延伸的溫度過高，那么會對引物和模板的結合不理。延伸的反應時間取決于待擴增片段的長度。如果DNA片段的長度在1kb以內，那么延伸時間1分鐘足夠。如果靶序列的長度為3-4kb，延伸時間需要3-4分鐘，如果擴增10kb的長度，那么延伸時間需要到15分鐘。如果延伸時間過長的話，會引起非特異性擴增，如果擴增的模板濃度低，那么需要適當延長延伸時間。

2.循環(huán)次數(shù)

循環(huán)的次數(shù)決定了PCR的擴增程度，循環(huán)的次數(shù)主要由模板DNA的濃度決定。循環(huán)的次數(shù)一般選在30次左右，循環(huán)的次數(shù)越多，非特異性產物的量也隨之增加。

PCR產物檢測

瓊脂糖凝膠電泳（Z常用）、PCR擴增產物的直接測序、限制性內切酶酶切分析、分子雜交、層析技術：GX液相色譜（HPLC）和離子交換層析（IEC）以及聚丙烯酰胺凝膠電泳。