引言

TA儀器經(jīng)典的Nano DSC差示掃描量熱儀是一款用于監(jiān)測中短鏈寡核苷酸在低濃度下熱穩(wěn)定性的成熟工具^[1,2]。其毛細(xì)管樣品池的靈敏度更高，但在低濃度(<1mg/mL)下測定的寡核苷酸穩(wěn)定性可能無法充分反映生物治療制劑在更高配方濃度下的穩(wěn)定性。而近年新推出的RS-DSC快速篩選差示掃描量熱儀則搭載突破性的微量熱技術(shù)，可直接使用低體積、高配方濃度樣品進(jìn)行大分子熱穩(wěn)定性篩選，無需樣品稀釋和清洗。

寡核苷酸藥物(ONs)是一種新興藥物類別，旨在通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來治療疾病^[3,4]。最常見的ONs藥物包括反義寡核苷酸(ASOs)和小干擾RNA(siRNA)藥物。盡管ASO和siRNA類藥物通過不同機(jī)制發(fā)揮療效，但二者均通過Watson-Crick堿基配對與靶向RNA結(jié)合來激活或抑制基因表達(dá)。熔解溫度(T_m)指一半DNA分子雙鏈結(jié)構(gòu)解離為單鏈時的溫度，是設(shè)計寡核苷酸藥物序列的關(guān)鍵參數(shù)。研究表明，許多DNA結(jié)合藥物的治療效果與其復(fù)合物的熱力學(xué)特性密切相關(guān)^[5]。

差示掃描量熱分析(DSC)是一種用來獲取核酸、修飾核酸及核酸-配體相互作用熱力學(xué)特性的寶貴工具(圖1)。除了直接測量核酸復(fù)合物的熔解溫度外，它還能直接測量熱焓(ΔHcal)，理解吉布斯自由能變化(ΔG)和熵變(ΔS)。通過DSC技術(shù)，可清晰闡明核苷酸鏈長度、核苷酸濃度以及配方條件(包括緩沖液、賦形劑、pH值和離子強(qiáng)度)的影響。

對兩種市售ASO藥物的衍生物進(jìn)行了評估。EXONDYS 51? Eteplirsen是一種長度為30個核苷酸的磷酰二胺嗎啉代反義寡核苷酸，于2016年獲批用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥。該反義寡核苷酸制劑濃度為50mg/mL，通過靜脈輸注給藥^[6]。

TEGSEDI? Inotersen是一種長度為20個核苷酸、具有g(shù)apmer結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸，獲批用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性(hATTR)患者的多發(fā)性神經(jīng)病變。其制劑濃度為200mg/mL，每周皮下注射給藥^[7]。

實驗方法

為進(jìn)行量熱分析，將11μL寡核苷酸樣品直接移入一次性玻璃微流控芯片(MFC)中加樣后，使用玻璃蓋片密封微流控芯片，確保樣品在加熱至100°C的過程中保持完好。將密封好的微流控芯片置于RS-DSC的樣品側(cè)。將一個可重復(fù)使用的聚醚醚酮(PEEK)芯片置于參考側(cè)。該量熱儀可在20-100°C溫度范圍內(nèi)，以1或2°C/min的預(yù)設(shè)掃描速率同時處理多達(dá)24個樣品。采用一次性微流控芯片，一個工作日通?？赏瓿啥噙_(dá)96份樣品的檢測。

通過TA儀器RSDSCRun軟件操作TA儀器RS-DSC，每次掃描開始前在初始溫度下平衡30分鐘。在20-100°C的溫度范圍內(nèi)，以1或2°C/min的速率掃描每個樣品。

使用NanoAnalyze?軟件(4.1.0版)處理數(shù)據(jù)。自動檢測差示掃描量熱圖中的基線、T_max和T_onset參數(shù)軟件可導(dǎo)出自動分析生成的表格數(shù)據(jù)用于輕松對比。

結(jié)果與討論

不同濃度寡核苷酸的篩選

熱穩(wěn)定性是寡核苷酸藥物產(chǎn)品的一項關(guān)鍵質(zhì)量屬性，受鏈長、G:C含量、濃度及其緩沖體系的離子強(qiáng)度影響^[8]。差示掃描量熱儀(DSC)是表征生物分子熱力學(xué)特征的首選工具。而RS-DSC兼顧通量濃度適應(yīng)性，可實現(xiàn)制劑濃度下寡核苷酸候選藥物的快速篩選。

對獲批ASO藥物inotersen和eteplirsen的天然DNA類似物在不同濃度下進(jìn)行了三次重復(fù)數(shù)據(jù)分析。本研究篩選的濃度最高約為70mg/mL，而某些獲批核酸療法制劑濃度可達(dá)200mg/mL^[4]。RS-DSC采用一次性微流控樣品芯片，專為容納此類高濃度制劑而設(shè)計，支持直接對未稀釋藥物進(jìn)行熱穩(wěn)定性測試。

寡核苷酸的熔解溫度對應(yīng)50%的螺旋雙鏈體分離為單鏈盤繞構(gòu)象時的溫度。Inotersen類似物為20堿基對的DNA鏈，GC含量為40%。在各濃度下熔解溫度均表現(xiàn)出優(yōu)異的重現(xiàn)性，且濃度與Tm值之間存在顯著正相關(guān)性——當(dāng)濃度從1.4 mg/mL增加至72mg/mL時，熔解溫度偏移超過7°C(圖2A)。同樣，eteplirsen類似物為30堿基對的互補(bǔ)DNA鏈，GC含量為43%。其熔解溫度亦隨濃度變化而變化，從1.4mg/mL時的76.79°C到72mg/mL時的81.70°C(圖2B)。兩種寡核苷酸三次重復(fù)實驗的平均T_max值及標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。

表1：20及30堿基對雙鏈體濃度篩選的轉(zhuǎn)變溫度

平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3

配方緩沖液篩選

PCR經(jīng)驗表明，在引物選擇中，隨著陽離子鹽濃度的增加，寡核苷酸的熱穩(wěn)定性會隨之提高^[9]。在通常情況下，鹽濃度升高會導(dǎo)致寡核苷酸熔解溫度(T_m)升高；但每個序列和結(jié)構(gòu)都具有獨特性，因此需要通過DSC進(jìn)行進(jìn)一步測試。當(dāng)測試濃度為10、20和40mg/mL時，在磷酸鹽緩沖液中添加75或150mM NaCl后，eteplirsen類似物的熱穩(wěn)定性得到增強(qiáng)(圖3)。插圖中的范特霍夫曲線清晰顯示：未添加NaCl的樣品，其濃度依賴性遠(yuǎn)高于75mM或150mM NaCl處理組。各樣品條件下的平均熔解溫度(T_m)與熔解起始溫度(T_onset)詳見表2。

etepliresen類似物的熱穩(wěn)定性不受pH值影響(圖4和表3)，在整個pH值范圍內(nèi)均保持一致。

結(jié)論

篩選溶液環(huán)境和序列修飾對短期熱穩(wěn)定性的影響對開發(fā)高質(zhì)量的藥用寡核苷酸至關(guān)重要。TA儀器RS-DSC可通過在制劑濃度下同時測試多達(dá)24個樣本實現(xiàn)熱穩(wěn)定性的高通量篩選。本文展示了如何對雙鏈體DNA寡核苷酸進(jìn)行精確且可重復(fù)的分析，并快速測定緩沖液成分對整體熱穩(wěn)定性的影響，然后利用數(shù)據(jù)處理軟件NanoAnalyze的新算法對高通量篩選中產(chǎn)生的大量熱力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行高效分析?？傊?，TA儀器RS-DSC為表征寡核苷酸的熱穩(wěn)定性提供了全新平臺，為確保產(chǎn)品質(zhì)量和支持注冊備案提供了重要手段。

本文由TA儀器的Christine S. Nervig博士、Viviana Costa博士和Samuel Redstone博士共同撰寫，范洋晶校對。

TA Instruments和NanoAnalyze是沃特世公司的商標(biāo)。EXONDYS 51是Sarepta Therapeutics, Inc的商標(biāo)。TEGSEDI是Akcea Therapeutics, Inc的商標(biāo)。NanoDrop是NanoDrop Technologies LLC的商標(biāo)。Gibco是Life Technologies Corporation的商標(biāo)。